【国家标准】 酶制剂质量要求 第1部分：蛋白酶制剂

ICS67.220.20
CCSX69
中华人民共和国国家标准Www.bzxZ.net
GB/T23527.1—2023
代替GB/T23527-2009
酶制剂质量要求
第1部分：蛋白酶制剂
Quality requirements for enzyme preparations-Part1:Proteasepreparation2023-03-17发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-04-01实施
GB/T23527.1—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件规定了食品质量相关技术要求。食品安全相关要求见有关法律法规、政策和食品安全标准等文件。
本文件是GB/T23527《制剂质量要求》的第1部分。GB/T23527已经发布了以下部分：第1部分：蛋白酶制剂。
本文件代替GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》，与GB/T23527—2009相比.除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：
—增加了术语“蛋白酶制剂”\蛋白酶活力单位\（见3.2、3.3)；更改了“蛋白酶活力”的定义（见3.4，2009年版的3.2）；更改了理化要求中的“活力”要求（见表2，2009年版的表1）：删除了“卫生要求”（见2009年版的5.3）；更改了干燥失重和细度的试验方法（见6.3、6.4，2009年版的6.3、6.4）；更改了出厂检验项目（见7.3.2009年版的7.3.1)；更改了标志的内容（见8.1，2009年版的8.1）：删除了“保质期”（见2009年版的第9章）；删除了“国内常用蛋白酶制剂的类别、代号与生产菌\的清单（见2009年版的附录A）；增加了“蛋白酶活力的测定福林法”中其他缓冲溶液（见A.3.8.4）；增加了“蛋白酶活力的测定紫外分光光度法”中的其他底物（见B.3）：一更改了“碱性蛋白酶活力的测定全自动生化分析法”中的试剂（见C.3，2009年版的D.4)；增加了“蛋白酶活力的测定微量比色法”的试验方法（见附录D）。请注意本文件的某此内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国食品工业标准化技术委员会（SAC/TC64)提出并归口。本文件起草单位：中国食品发酵工业研究院有限公司、中国生物发酵产业协会、诺维信（中国）投资有限公司、山东隆科特酶制剂有限公司、杰能科（中国）生物工程有限公司、武汉新华扬生物股份有限公司、英联酶制剂贸易（上海）有限公司、白银赛诺生物科技有限公司、广州焙乐道食品有限公司、湖南新鸿鹰生物工程有限公司帝斯曼（中国）有限公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、天野酶制剂（江苏）有限公司上海分公司、安琪酶制剂（宜昌）有限公司、江苏奕农生物股份有限公司、南京百斯杰生物工程有限公司、宁夏夏盛实业集团有限公司、北京昕大洋科技发展有限公司、河南新仰韶生物科技有限公司、青岛根源生物技术集团有限公司、山东省鲁洲食品集团有限公司、浙江养生堂天然药物研究所有限公司、中山市南方新元食品生物工程有限公司。本文件主要起草人：刘明、陈楠楠、王晋、张峻炎、郭庆文、齐延芳、周樱、裴静、俞峰、童远洋、黄石桥、杜建华、陈亮珍、王友谊、杜支红、常东民、徐红、沈涛、郭宝林、焦国宝、张宗国、赵玉斌、黄志明、刘高峰、郭新光、王洁、王金风、钱娟娟、王健蕾、徐丽、权中华、杨忠义、高铁成、易鸣、袁琳、邵静、李英玉、喻晨、王俊峰、朱伟、程伟、余艳、何景阳、邓娟娟、周莉芬、主校冬、由关娥。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：一本文件于2009年首次发布：
一本次为第一次修订。
GB/T23527.1—2023
随着酶制剂工业的迅速发展，酶制剂种类向多元化发展，产品质量提高到一个新的水平，行业从技术到品种都有了长足的进步与发展。制定GB/T23527《制剂质量要求》，是对酶制剂的产品质量和检测方法的规范化和标准化，是规范酶制剂及相关产品行业秩序、促进产业发展的基础性工作。GB/T23527《酶制剂质量要求》拟由四个部分构成：—第1部分：蛋白酶制剂；
一第2部分：脂肪酶制剂；
第3部分：α-淀粉酶制剂；
第4部分：固定化葡萄糖异构酶制剂随着蛋白酶制剂行业产品创新发展，根据行业产品调研和征集产品种类，除了原标准范围涵盖的微生物发醇来源的蛋白酶制剂产品，还有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等植物组织提取产品和胃蛋白酶、胰蛋白酶等动物组织提取产品。另外，根据国内外检测方法行业产品发展需要，在本次修订中，对GB/T23527一2009酶活力测定方法的测定条件进行了更新完善，并增加了微量比色法。1范围
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酶制剂质量要求第1部分：蛋白酶制剂本文件规定了蛋白酶制剂的产品分类、要求、检验规则、标志、包装、运输和贮存，并描述了试验方法
本文件适用于微生物发酵或植物组织来源的蛋白酶制剂的生产、检验和销售。规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T191
GB/T601
GB/T602
GB/T603
GB/T6682
QB/T1803
术语和定义
包装储运图示标志
化学试剂
标准滴定溶液的制备
化学试剂
化学试剂
杂质测定用标准溶液的制备
试验方法中所用制剂及制品的制备分析实验室用水规格和试验方法工业酶制剂通用试验方法
下列术语和定义适用于本文件。3.1
蛋白酶
protease
能催化水解蛋白质分子内部的肽键，使其转化为多肽或氨基酸的酶。3.2
蛋白酶制剂
Jproteasepreparations
以提取、纯化的蛋白酶为主要催化活性组分，通过制剂等工艺制得的产品。注：制剂工艺中可加人有助于产品整存、稳定和使用的配料。3.3
蛋白酶活力单位
activityunitofprotease
在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸所需的蛋白酶量.即为1个酶活力单位。
注：以“U\表示
protease activity
蛋白酶活力
蛋白酶制剂的酶活力
activityofproteasepreparations催化蛋白质水解为多肽和氨基酸的能力，表示为1g固体蛋白酶制剂（或1mL液体蛋白酶制剂）含有的酶活力单位。
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注：以U/g或U/mL表示，
产品分类
按产品的应用领域
食品工业用和其他工业用蛋白酶制剂。按产品的形态
固体剂型和液体剂型蛋白酶制剂。按产品的作用pH范围
酸性、中性和碱性蛋白酶制剂。要求
感官要求
应符合表1的规定。
理化要求
应符合表2的规定
酶活力/（U/g或U/mL）
干燥失重/%
感官要求
固体剂型
白色至黄褐色
粉末或颗粒，无结块、潮解现象液体剂型
浅黄色至棕褐色
液体，允许有少量凝聚物
无异味，微生物发醇产品或有特殊发酵气味表2
细度（通过网孔尺寸0.40mm的试验籍）/%也可按供需双方约定酶活力要求执行。不适用于颗粒产品。
试验方法
感官要求
理化要求
固体剂型
符合声称
称取样品10g或10mL于洁净、干燥白瓷盘，观察、嗅闻.作出判断，做好记录液体剂型
符合声称
6.2酶活力
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按附录A进行检测，也可参考附录B，附录C、附录D或采用其他方法进行检测。检测结果应标明测定的方法，必要时，还应标明缓冲溶液和底物。3干燥失重
按QB/T1803中干燥失重的试验方法执行6.4细度
按QB/T1803中细度的试验方法执行·标准试验筛选择@200×50一0.40/0.25检验规则
7.1批次
同原料、同配方、同工艺、同生产线连续生产的产品为一批。7.2抽样
抽样的样本量可按照表3执行，或由生产企业和（或）相关方确定。每个最小外包装单位的取样量应不小于300g或300mL.不足时按照比例适当加取。充分混合均匀后进行检验表3抽样的样本量
批量范围（最小外包装单位）
50（含）以下
51~500（含）
500以上
抽样的样本量（最小外包装单位）2
注：批量范围是指批中所包含的最小外包装单位数量，抽样的样本量是指抽取样本的最小外包装单位数量7.3
出厂检验
出厂。
产品出厂前，应由生产厂的质检部门负责按本文件规定逐批进行检验。检验符合本文件后方可检验项目如下：
固体剂型的检验项目：感官要求、酶活力、于燥失重、细度。b)
液体剂型的检验项目：感官要求、酶活力。型式检验
检验项目，本文件中全部要求项目。一般情况下，同一类产品的型式检验每年至少进行一次，有下列情况之一者·亦应进行：
原辅材料有较大变化时：
更改关键工艺或设备时：
新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时：出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时：GB/T23527.1—2023
国家监督机构按有关规定需要抽检时7.5
5判定规则
7.5.1抽取样品经检验，所检项目全部符合要求，判该批产品符合本文件。7.5.2检验结果如有两项以上指标不符合要求，判定该批产品不符合本文件。如有一项至两项不符合要求，应重新自同批产品中抽取样本量的两倍进行复检，以复检结果为准。若仍有一项不符合要求，判定该批产品不符合本文件
7.5.3当供需双方对检验结果有异议时，可由双方协商解决，或委托有关单位进行仲裁检验，以仲裁检验结果为准。
8标志、包装、运输和贮存
8.1标志
销售包装使用标签时，应标注产品类型和酶活力。8.1.1
8.1.2包装贮运图示标志应符合GB/T191的要求包装
包装容器应整洁、无破损。
3运输
运输工具应清洁卫生，不应与有毒、有害、有腐蚀性和含有异味的物品混装、混运，应避免受潮、受压、暴晒。装卸时，应轻拿轻放，不应直接钩扎包装。8.4贮存
应存在通风、干燥、清洁的仓库内，严防日晒雨淋，严禁火种。不应与有毒、有害、有腐蚀性和含有异味的物品放在一起
A.1原理
附录A
（规范性）
蛋白酶活力的测定
福林法
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蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸在碱性条件下，还原福林试剂生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm处测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。A.2
仪器和设备
电子天平：感量为0.1mg：
分光光度计。
恒温水浴锅。
A.2.4pH计：精度为0.01。
试剂和溶液
本方法中所用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T6682中三级水的规格，所用试剂，在未注明其他规格时，均指分析纯。分析中所用标准滴定溶液，杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备。A.3.1福林试剂
于2L磨口回流装置中分别加人100.0g钨酸钠（NaWO，·2H,O）、25.0g钼酸钠（NaMoO：2H，O）、700ml水、50mL磷酸（85%）、100mL浓盐酸，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加人50g硫酸锂（LiSO）、50mL水和数滴浓溴水（99%）.再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，转移至1000mL容量瓶中，蒸馏水定容，混匀并过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内，A.3.2
福林使用溶液
量取50mL福林试剂（A.3.1)）和100mL水，混合均匀。注：也可使用市售福林溶液配制。A.3.3
碳酸钠溶液（0.4mol/L）
称取42.4g无水碳酸钠（NaCO），用水溶解并定容至1L。A.3.4三氯乙酸（0.4mol/L）
称取65.4g三氯乙酸，用水溶解并定容至1L。A.3.5氢氧化钠溶液（20g/L）
称取20.0g氢氧化钠，加水900mL并搅拌溶解。待溶液到室温后水定容至1L。5
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盐酸溶液（1.0mol/L）
移取8.3mL浓盐酸于盛有80mL水的容量瓶中，水定容并摇匀A.3.7
盐酸溶液（0.1mol/L)
移取0.83mL浓盐酸于盛有80mL水的容量瓶中，水定容并摇匀。A.3.8
缓冲溶液
磷酸缓冲溶液（pH=7.5.适用于中性蛋白酶制剂）A.3.8.1
分别称取6.02g磷酸氢二钠（Na2HPO,·12H.O)和0.5g磷酸二氢钠（NaH，PO，·2H2O)，加水溶解并定容至1000mL：盐酸溶液（A.3.6）或氢氧化钠溶液（A.3.5）调节pH至7.50士0.05A.3.8.2乳酸钠缓冲溶液（pH=3.0.适用于酸性蛋白酶制剂）称取4.71g乳酸（80%~90%）和0.89g乳酸钠（70%）于900mL水中，搅拌溶解后，用乳酸或乳酸钠调整pH至3.00士0.05定容至1000ml硼酸缓冲溶液（pH=10.5，适用于碱性蛋白酶制剂）A.3.8.3
称取9.54g硼酸钠、1.60g氢氧化钠于烧杯中.加水900mL，搅拌至均匀。用盐酸溶液（A.3.6）或氢氧化钠溶液（A.3.5）调整pH至10.5士0.05.定容至1000mL，A.3.8.4其他缓冲溶液
生产者和使用者还可以探讨使用表A.1中缓冲溶液或其他适用的缓冲体系。表A.1其他缓冲溶液参考配制方法缓冲体系
乙酸钠缓冲溶液
磷酸盐缓冲溶液
(pH=6.0）
Tirs缓冲溶液
参考配制方法
称取4.10无水乙酸钠于900mL水中充分溶解后，加人3.00g冰乙酸，再用盐酸溶液(A.3.6）或氢氧化钠溶液（A.3.5）调整pH至4.7士0.05，水定容至1000mL称取17.9g十二水合磷酸氢二钠（NaHPO·12HO）于800mL水中，充分溶解后，盐酸溶液(A3.6）调节pH至6.0±0.05.加水定容至1000mL称取6.06g2-氨基-2-（羟甲基）-13-丙二醇（Tris碱）于800ml.水中，充分溶解后·盐胶溶液（A.3.6）或氢氧化钠溶液（A.3.5）调节pH至8.5±0.05.加水定容至1000mL底物溶液（10.0g/L）
称取1.00g蛋白酶制剂专用酪蛋白底物（精确至0.001g）于烧杯中，加人相应的缓冲溶液约80mL，置于沸水浴保持30min.期间不断搅拌至酪蛋白全部溶解。冷却至室温后转入100mL容量瓶中，盐酸溶液（A.3.6)或氧氧化钠溶液（A.3.5)调节至相应pH后，用相应pH缓冲溶液定容。此溶液4℃保存.有效期为3d。使用前重新确认并调整pH至规定值不同来源或批号的酪蛋白对试验结果有影响，如使用不同的酪蛋白作为底物，使用前应与以上蛋白酶制剂专用酪蛋白底物进行结果比对L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）A.3.10
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称取0.100g经105℃干燥至恒重的L酪氨酸（精确至0.0001g）于烧杯中.加人60mL盐酸溶液（A，3.6），充分溶解后转移至100mL容量瓶中，盐酸溶液定容并摇匀。再吸取10.00mL至100mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液（A.3.7）定容并摇匀。A.4
分析步骤
标准曲线的绘制
L-酪氨液系列标准工作溶液按表A.2配制表A.2
L-酪氨酸系列标准工作溶液
L-骼氨酸标准溶液的浓度
L-酪氨酸标准储备溶液(A.3.9>的体积mL
加水的体积
分别取1.00mL表A.2中标准溶液于玻璃试管中，加入5.00mL碳酸钠溶液（A.3.3）和1.00mL福林试剂使用溶液（A.3.2).振荡混，置于40℃土02℃水浴中反应20min，取出冷却至室温。以0管为空白，分别采用10mm比色杯测定系列标准工作溶液在680nm处的吸光值。以吸光值为纵坐标L-酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。A.4.1.3利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg）.即为吸光常数K值。其K值应在95～100范围内。如不符合，需重新配制试剂，进行试验。注，L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。A.4.2
样品的测定
待测酶液的制备
称取1.0g蛋白酶制剂样品（精确至0.0001g）加人80mL相应缓冲溶液.搅拌溶解30min，随后转移至100mL容量瓶中，用相应缓冲溶液定容并混匀。移取适量酶液加入相应缓冲溶液稀释到酶活力在10U/mL~15U/mL之间。
A.4.2.2.1
A.4.2.2.2
A.4.2.2.3
将酪蛋白溶液置于40℃土0.2℃恒温水浴中，预热5min。按表A.3程序操作。
中性蛋白酶如枯草芽抱杆菌No.1.398和放线菌No.166来源.除标准曲线和样品测定的反应温度和显色温度为30℃±0.2℃，其他操作同上。7
GB/T23527.1—2023
试管A（空白)
加酶液1.00mL.40℃±0.2℃.2min2
加三氯乙酸2.00ml（摇勺）
40c±02c.10min
加酪蛋白溶液1.00mL（摇匀）
操作程序
试管B（蛋白酶样品，需做3个平行试样）加酶液1.00ml.40C±0.2℃.2mim加酪蛋白溶液1.00mL（摇勾）
40℃±0.2C.10min
加三氧乙酸2.00mL（摇匀）
取出静置10min过滤（慢速定性滤纸）取1.00mL滤液，加入5.0mL碳酸钠溶液，1.0mL福林使用溶液.40℃C士0.2℃.显色20min以试管A为空白.680nm波长处，用10mm比色皿测定试管B的吸光度样品的酶活力按式（A.1）计算：式中：
X=×V/×4Xn
样品的酶活力，单位为酶活力单位每克（U/g）：..........(A1)
+..+...+..+
由标准曲线得出的蛋白酶水解产生的L-酪氨酸的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）：溶解样品所使用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL）：反应试剂的总体积单位为毫升（mL)；样品的稀释倍数；
样品的质量，单位为克（g）：
反应时间，单位为分（min）
计算结果表示至整数
精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的5%。B.1原理
附录B
（资料性）
蛋白酶活力的测定紫外分光光度法GB/T23527.1-2023
蛋白酶在一定的温度与PH条件下，水解酪蛋白或血红蛋百底物生成酪氨酸·加人三氯艺酸终正酶反应·并沉淀未水解的底物，滤液中的酪氨酸使用紫外分光光度计在275nm下进行测定。根据吸光度与酶活力的比例关系计算其酶活力。不同的蛋白酶制剂其紫外法结果与福林法结果的换算系数不同。如需要，相关方可根据试验结果统计，确定两个方法的换算系数。B.2
仪器和设备
同A.2。
B.3试剂和溶液
同A.3。
根据蛋白酶不同性质，除A.3中使用的酪蛋白底物，也可选用表B.1中规定的血红蛋白底物或其他适宜底物。
表B.1血红蛋白底物参考配制方法底物
血红蛋白
参考配制方法
称取4.0g血红蛋白.精确至0.001g+加人100ml水后搅排10min用0.1mol/L盐酸溶液调节pH至1.70士0.05，搅10min至全部溶解后.0.5mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.70士0.05.转入200mL容量瓶·水定容井混匀
B.4分析步骤
求K值
按福林法的表A.1配制不同浓度的L-酪氨酸标准溶液，然后·直接用紫外分光光度计测定其吸光度（A），并计算K值。K值应在130～135范围内，如不符合.需重新配制试剂，进行试验B.4.2
待测酶液的制备
同A.4.2.I。样品稀释液最终的浓度应该在10U/ml~20U/mL范围之内B.4.3测定
操作同A.4.2.2中的取液、反应、静置沉淀.直至过滤。滤液用紫外分光光度计.在275nm波长处，测定其吸光度。
注：如结果不平行，可以考虑将加人三氟乙酸的试样溶液返回到水浴中保温30min.然后再测定吸光度B.5计算
从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为U/mL。样品的酶活力按式（B.1）计算9
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