【YY医药标准】 微量青霉素试验方法

备案号：382—1997
中华人民共和国医药行业标准
YY/T 0251-—1997Www.bzxZ.net
微量青霉素试验方法
Testmethodsofpenicillin
1997-06-09发布
国家医药管理局
1997-10-01实施
YY/T0251-1997
本标准制定中，清场后环境、设备中残留微量青霉素的采样方法等效采用了日本工业协会GMP委员会编《防止交叉污染指南》，其他部分非等效采用了美国食品药品管理局的《食品及药品中的青素污染》和美国联邦法规的有关内容。本标准起草单位：上海四药股份有限公司、华北制药股份有限公司、鲁抗医药股份有限公司。本标准主要起草人：林少坚、李令梅、颜喜亚、麦加。1范围
中华人民共和国医药行业标准
微量青霉素试验方法
Test methods of penicillin
本标准规定了用微生物法测定微量青素的试验方法。YY/T0251-1997
本标准适用于成品、清场后环境、设备及空气中微量青霉素的测定。最小检出量0.008u/mL。2引用标准
下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文，本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。中华人民共和国药典1995年版二部3方法提要
利用抗生素的抗菌性质及在琼脂培养基内的扩散渗透作用，将被检物放入摊布高度敏感检定菌的培养基上，产生抑菌圈，根据抑菌圈直径判断青霉素污染，再根据标准曲线或数学公式计算出污染青霉素的量。
4试剂和溶液
本试验所用试剂除特殊注明外均为分析纯，所用水均为蒸馏水。4.1青舞素标准品。
4.2乙酸正戊酯。
4.3培养基Ⅱ：中华人民共和国药典1995年版二部（或培养基I：美国药典XX版）。4.4营养琼脂培养基：中华人民共和国药典1995年版二部。4.510g/L磷酸盐缓冲液：pH=6.0称取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加蒸馏水至1000mL，滤过，在115℃灭菌30min。4.6100g/L磷酸盐缓冲液：pH=2.5称取100g磷酸二氢钾，溶于800mL蒸馏水中，加0.2mL浓盐酸，再加蒸馏水至1000mL.用磷H,PO.）=6mol/L］调节pH值，使灭菌后pH为2.2~2.5，备用。酸溶液Lc（
4.710g/L磷酸盐缓冲液：pH=2.5将磷酸盐缓冲液（4.6)稀释10倍。4.8青霉素酶溶液
用鲜肉汤将浓的青霖素酶溶液稀释到1000u/mL37℃恒温培养5天，5℃以下冰箱保存备用。4.9磷酸溶液：c(
HPO,)=6mol/L
取85%磷酸12.3mL加蒸馏水17.7mL。4.10检定菌液
国家医药管理局1997-06-09批准1997-10-01实施
YY/T0251-1997
4.10.1藤黄微球菌ATCC9341检定菌液将工作用菌种ATCC9341的斜面培养物，接种于营养琼脂培养基斜面上，32～35C培养24h，然后用灭菌生理盐水洗下，此菌液5C以下冰箱保存可用15天，使用前以青霉素标准液（0.04u/mL）标定，100ml培养基内加菌量所致抑菌图直径15～18mm为宜。4.10.2藤黄微球菌ATCC9341a2（耐50mg/mL链霉素）检定菌液将工作用菌种ATCC9341a代替4.10.1工作用菌种ATCC9341，其他操作步骤按4.10.1进行。5仪器和材料
5.1培养血：内径90mm，皿深1617mm，硬质玻璃，皿底平坦，光洁，薄厚均匀、透明。5.2钢管（牛津杯）.不锈钢制，外径7.8mm士0.1mm，内径6.0mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm，同批钢管的重量极差不超过0.05g.内外光亮，无凹凸痕迹。5.3吸管：1mL、2mL5mL、10mL.A级。5.4容瓶：50mL、100mL，A级。
5.5分液漏斗：150mL。
5.6陶瓦盖：内径103mm，外径108mm，表面平坦，吸水性强。5.7生化培养箱：28℃士1℃。
5.8恒温水浴箱：控温范围0~100℃。5.9微波炉或电炉。
5.10电热干燥箱：控温范围40~250℃。钢管放置器：六孔直落式。
操作台：光滑、水平。
6操作步骤
6.1非青霉素类药品中微量青赛素的测定6.1.1采样
采样量：逐批按件数、瓶数取样，设总件数为n。当n≤3时，每件（瓶）都取，当3n+1取样量随机取样，当n>300时，按-6.1.2青霉素标准溶液的制备
6.1.2.1标准母液A液(1000u/mL)的制备称取青霉素标准品0.002~0.005g（精确至0.0002g），用磷酸盐缓冲液（4.5）稀释成1000u/mL，5C以下冰箱保存可用3天。
6.1.2.2标准使用液的制备
将A液取出，放置到室温，用刻度吸管取A液1.0mL至50mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（4.5）稀释成浓度为20u/mL的B液，取B液2.5mL至50mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（4.5）稀释成浓度为1u/mL的C液，取C液2.0mL至50mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲液（4.5）稀释成浓度为0.04u/mL的D液。
6.1.3试样液的制备
6.1.3.1直接法3
称取试样适量（精确至0.0002g），用磷酸盐缓冲液（4.5）稀释成0.35g/mL的试样液，然后按表11）ATCC9341适用于溶媒萃取法测定。2）ATCC9341a适用于直接法测定.3）直接法适用于链霉素类的抗生素药品。2
再稀释。
样品号
6.1.3.2溶媒萃取法1
样品液
(0.35g/mL)
YY/T0251-1997
磷酸盐缓冲液
青霉素标准使
(6.1.2.2C液）
青霉素酶溶液
称取试样1.0g（精确至0.0002g），放入50mL烧杯中，用滴定管加18mL蒸馅水溶解，用刻度吸管吸2mL上述溶液放入试管中加18mL蒸增水稀释，取9mL作为第一份试样。置分液漏斗中，用量简加20mL乙酸正戊酯（4.2），加1mL磷酸盐缓冲液（4.6），振摇，分层后将水层放入第二支分液漏斗中，如水溶液pH值大于3.0，用磷酸溶液（4.9）调节至pH2.5，不得超过5min，在第二支分液漏斗中再加20mL乙酸正戊酯第二次萃取，合并萃取物，分别用10mL磷酸盐缓冲液（4.7）洗涤4次，除去洗涤液，在乙酸正戊酯中加人磷酸盐缓冲液（4.5)10mL，使青霍素从乙酸正戊酯中转入磷酸盐缓冲液（4.5)中静置分层，收集水层溶液。同时做阳性对照实验，即用刻度吸管另取第二份试样8.6mL，加入青素标准使用液（6.1.2.2)C液0.4mL，重复上述操作。样品萃取物
对照品萃取物
6.1.4测定
『取4ml.加磷酸盐缓冲液（4.5）1mL...样1L取4mL加青霉素酶溶液（4.8）1mL.样3「取4mL加磷酸盐缓冲液（4.5）1mL.样2取4mL加青霉素酶溶液（4.8）1mL.样46.1.4.1培养皿平板的制备
将培养基「溶化后，放入恒温水浴（5.8)中保持48～50C，加入适量相应的检定菌混匀、用青霉素标准使用液（6.1.2.2)D液标定检定菌液，使其产生的抑菌圈直径在15~18mm，用灭菌吸管加入10mL含检定菌的培养基于每套培养皿内，立即盖上玻盖，待凝固20min后，即可使用。6.1.4.2滴装与培养
取制备好的培养皿，编上记号，每批两套；用六孔直落式钢管放置器（5.11)等距离放置6个钢管，按图1顺时针方向滴装。
样5.磷酸盐缓冲液（4.5）
样6:青霉索标准使用液(6.1.2.2)D液图1
1）溶媒萃取法适用于土霉素、盐酸林可荐索、硫酸卡那郡素、硫酸庆大霉素原粉、盐酸克林霉素原粉。YY/T0251-1997
滴完后，室温放置2h，水平移入28C士1℃生化恒温培养箱（5.7)中，培养16～18h。6.1.5结果判断
a）样2、样6为阳性，样1、样3、样4、样5为阴性，即无微量青霉素污染。b）样1、样2、样6为阳性，样3.样4、样5为阴性，其中样6的标准圈直径应控制在15～18mm，样1的抑菌图直径超过9mm，判为有青霉素污染。c）样1、样2、样3、样4、样6为阳性，样5为阴性，说明有其他抑菌物或检菌变异，要重检。d）样1、样2、样3、样4、样5、样6都为阳性，可能是缓冲液被污染，要重检。e）样1、样2、样3、样4、样5、样6都为阴性，可能是培养基不敏感或有其他抑菌物，要重检。f）如成品中有微量青霉素被检出.则应测其直径，按标准曲线法进行定量分析。6.1.6标准曲线的绘制
6.1.6.1标准曲线用青霉素标准溶液的制备称取青霉素标准品0.002~0.005g（精确至0.0002g），用磷酸盐缓冲液（4.5）分别配制成0.01u/mL.0.025u/mL、0.04u/mL，0.08u/mL，0.16u/mL的溶液。6.1.6.2标准曲线的绘制和计算
取消毒好的培养血10套，照6.1.4.1制备培养血平板，每血以圆心为中心等距离放暨5支钢管，以标记的字为起点，按顺时针在5支钢管内分别滴入5种不同浓度的青霉素标准溶液，滴完后室温放至2h，然后放入28℃士1℃生化恒温培养箱培养16～18h，量取各抑菌圈的直径，求出每个浓度10套培养血抑菌图直径的平均值，以浓度为对数坐标，抑菌圈直径的平均值为算术坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。浓度的对数与抑菌圈直径在一定范围内呈直线关系，其斜率b按式（1）计算：n2(1) -(Z1) .(2y)
n-(r)2
式中：n-标准溶液浓度的个数
-浓度的对数；
y一一各标准浓度抑菌圈直径的平均值，mm。6.2清场后环境、设备中残留微量青舞素的测定6.2.1培养血平板的制备
按6.1.4.1方法进行。
6.2.2采样与培养
采样要注意清洗困难的死角，粉子粘着和容易有残留物的地方。.（1)
将已消过毒的浸透了蒸馏水的绸布（面积约10cmX10cm，每块折四下），在被测仪器、设备、墙壁、地面等擦拭，擦后的绸布球放于已制备好的培养血平板上，另取一制备好的培养Ⅲ平板不经任何处理作为空白，与被测培养Ⅲ-起放入28℃士1℃生化恒温培养箱，培养16～18h。6.2.3结果判断
6.2.3.1每套培养皿若有抑菌斑，记录斑点大小，可测量斑点直径的，以毫米（mm）计算，否则以占培养血总面积计算。
6.2.3.2每套培养Ⅲ不应有任何大小之抑菌斑作为合格，若有抑菌斑点，应采取必要的措施，加以防止。
6.2.3.3空白血细菌应生长良好，若不长菌，即培养基在准备测试过程中污染有抗生素，致使细菌不长，该批检测作废弃论，
6.3空气中微量青霉素的测定
6.3.1培养血平板的制备
按6.1.4.1方法进行。
6.3.2采样与培养
6.3.2.1采样点
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采样点的设置要充分考虑到青素生产的实际情况，人流、物流、气流等情况，可广泛地在工厂内的生产区周围、屋顶、通道、仓库、风口等采样检测，根据确定的采样点进行采样。6.3.2.2采样方法与培养
到采样点轻轻开启培养皿盖，暴露空气1min，采样完毕后，将培养Ⅲ放入洁净的容器中，空白即不打开培养Ⅲ盖暴露空气1min，一并带回试验室，28C土1C恒温培养1618h。6.3.3结果判断
按6.2.3进行。
中华人民共和国医药
行业标准
微量青霉素试验方法
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开本880×12301/16
字数10千字
印张3/4
1997年11月第一版
1997年11月第一次印刷
印数1—600
标目321—83
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