【YY医药标准】 医疗器械遗传毒性试验 第2部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

ICS 11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0870.2-2013
医疗器械遗传毒性试验
第2部分：体外哺乳动物细胞
染色体畸变试验
Test for genotoxicity of medical devices-Part 2:In vitro mammalian chromosome aberration test2013-10-21发布
英码的份
国家食品药品监督管理总局
2014-10-01实施
YY/T0870的总标题是《医疗器械遗传毒性试验》，包括以下部分：第1部分：细菌回复突变试验；
-第2部分：休外哺乳动物细胞染色体畸变试验第3部分：用小鼠淋凹瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验；第4部分：哺乳动物骨髓红细胞微核试验；第5部分：哺乳动物骨髓染色体畸变试验。有关其他方面的遗传毒性试验将有其他部分的标准。本部分为YY/T0870的第2部分。
本部分按GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T 0870.2—2013
YY/T0870的本部分是参考OECDNo.473(1997)《体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》并结合医疗器械/材料自身特点制定的。
本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分中国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC218)归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位：四川医疗器械生物材料和制品检验中心，国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心。
本部分起草人：王昕、尹下霞、刘成虎、梁洁、张鹏。YY/T0870.2—2013
GB/T16886.3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织（OECD)《化学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定而成，同时未给出详细的试验步骤，因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T0870参照OECD试验方法基本原则，并根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为GB/T16886.3中遗传毒性试验的补充方法标准。
YY/T0870的本部分参照OECDNo.473(1997)方法，在有或无代谢活化系统的情况下，将培养细胞与医疗器械/材料接触后再用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素）进行处理，通过对处于有丝分裂中期的动物细胞的染色体畸变情况进行分析，来评价试验样品潜在的致畸变性。YY/T0870的本部分的月的是为了筛选医疗器械/材料中具有导致哺乳动物细胞中染色休结构畸变潜能的物质。染色体结构畸变可能有两种类型，即染色体型和染色单体型，对于医疗器械/材料内含有的有萨化学物来说，多为诱导染色单体型畸变，但有时也可导致染色休型畸变。多倍休数目的增加可预示毒性物质可能诱导染色体数日畸变：然而，YY/T0870的本部分不适用于检测染色体数日畸变。YY/T0870的本部分需要使用体外代谢活化系统。但是，这种休外系统不能完全模拟哺乳动物的体内情况。宜注意山pH、渗透压的改变或高水平细胞毒性可能导致的假阳性结果。1范围
医疗器械遗传毒性试验
第2部分：体外哺乳动物细胞
染色体畸变试验
YY/T0870.2—2013
YY/T0870的本部分规定了医疗器械/材料体外哺乳动物细胞染色体畸变试验方法。注：口腔材料的体外哺乳动物细胞染色体精变试验见YY/T的216。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注尺期的版本适用丁本文件。凡是不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16886.1
医疗器诚生物学评价第1部分风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.3医疗器械生物学评价CB/T16886.5医疗器械生物学评价GB/T16886.12
医疗器械生物学评价
3术语和定义
育部分
遗传毒性、致瘤性和生殖声性试验第5部分，休外细胞毒性试验
第12部分样品制备与参照样品
GB/T168861,GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
染色单体型畸变chromatid-type aberratiaon染色体结构损伤，表现为一条染色单体断裂或染色单体间的断裂和重接。3.2
染色体型畸变
chromusom-type aberration
染色体结构损伤，表现为断裂或两条染色单体同一查点的断裂和重接。3.3
核内复制endoreduplication
DNA复制的S期后的一个过程，核没有进人有丝分裂，但进入下一个S期。结果是染色体具有4、8.16等倍单体。
裂隙gap
显示为小于染色单体宽度的不若色的损伤，并伴有染色单体极小的错位。3.5
有丝分裂指数
mitotic index
有丝分裂中期的细胞数除以观察细胞总数，表明细胞增殖的程度。3.6
染色体数目畸变
numerical aberration
染色体数目改变，不同于所用细胞染色体的正常数目。YYT0870.2--2013
多倍体polyploidy
所含染色体数目是单倍体染色体数（n）的倍数，二倍体除外（如，3n，4n等）。3.8
染色体结构畸变structuralaberration细胞分裂中期显微镜下观察到的染色体结构的改变，如缺失、断片、内交换或互换。4主要设备
超净工作台、CO，培养箱、恒温水浴箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器等。5活化系统、培养基和试剂
试验用活化系统（S9和S9混合液）、培养液和试剂按附录A和附录B的规定制备或购买市售商品。
6细胞株
可选用中国仓鼠肺细胞（CHL或中国仓鼠卵巢细胞（CHO），推荐首选CHL。需定期检查试验所用细胞核型和有无支原体污染。细胞应置于一80或液氮中冷冻保存。7试验前准备
7.1器具灭商
与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热T燥箱内160℃2h。
7.2试验环境要求
试验应在无菌操作台或超净上作台中进行8样品制备
宜根据GB/T16886.12的原则制备试验液。可采用生理盐水和/或其他适宜溶剂作为浸提介质。浸提介质不应与试验样品发生化学反应，且应对细胞的存活和S9的活性无影响。如怀疑试验样品可能对本试验细胞株产生毒性作用时，应进行预试验来确定适宜的试验液浓度，注1：ISO10993.3止在修订，当新的样品制备方在未来标准中得到确认后即可采用。注2：与经典的化学物全身毒性试验不同，医用材料一般得不到LD的剂量值。若采用浸提波进行试验，可考虑单剂量组试验（即试验样品原液或100%的浸提原液），但宫对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。注3：高浓度的DMSO具有细胞毒性作用。因此，如采用DMSO为浸提介质，使用时浓度应不人于1.0%（体积分数）。
9对照样品制备
9.1阴性对照bzxZ.net
同批号试验样品漫提介质，不加试验样品并在同条件下制备。阳性对照
见表1。也可采用其他适宜的阳性对照品。阳性对照物质举例
代谢活化条件
阳性对照物
甲磺酸甲酯(inethyl nethanesulphenate,MMs)[CAS No. 66-27-3]
甲磺酸乙酯（ethylmethanesulphonate，EMsTCAS No.62-50-0
无外源性代时活化系统
有外源性代谢活化系统
9.3空白对照
基亚基脉（ethlnitrogouree）
[CAS No. 759-73-9]
丝裂舞素C(mitamcinC)
CASNo.50-07-7]
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4-硝基唑啉-N-氛化物（4 mitruquinoline-N-oxide)CAS No. 56-57-57
基并（a）苗（benzo（a）pyrene）1CASN5087
环磷胺（cyelophosphamide)
[CAS No. 50-18-0 (CAS no. 6055-19-2）7
如不能证实所用浸提介质不具有致突变性，还应设空口对照。10试验步骤
10.1预试验
对怀疑有细胞毒性反应的试验样品应进行预试验。取试验细胞株按GB/T16886.5中步骤进行。如对试验细胞株产生毒性作用，应对试验样品或浸提液进行梯度稀释，所选的剂量浓度范围宜包括细胞毒性从最大到小或无细胞毒性，一般至少包括5个试验浓度梯度，并以小或无细胞毒性的浓度进行试验。
接触处理
试验分别在加入或不加人S9的条件下进行。按10.2.2～10.2.1步骤操作。YY/T 0870.2—2013
10.2.2试验前一大，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）内，置于CO培养箱内培养10.2.3吸去培养m（瓶）中的培养液，加入试验或对照样品、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）和细胞培养液，置于培养箱中。有或无代谢活化系统接触3h～6h，吸去培养血（瓶）中的液体，用Hanks液洗细胞3次，加人新鲜细胞培养液继续培养，并在接触开始后约1.5倍的止常细胞周期时采样。若两者均为阴性结果，宜再延长无代谢活化的试验至1.5倍的正常细胞周期采样。10.2.4于收获前2h~4h加人细胞分裂中期阻断剂（如秋水仙素，终浓度为0.1μg/mL~1μg/mL）10.3收获细胞与制片
10.3.1消化：用胰蛋白酶液消化细胞，待细胞脱落后加人含血清的细胞培养液终止胰蛋白酶作用，混匀，放人离心管内以1000r/min~1200r/min离心5min～7min，充去上清液。10.3.2低渗：加人0.075mol/L氯化钾溶液5ml~7mL，用滴管将细胞轻轻地吹打混勾，放人37%℃水浴中低渗处理10in~20min，加人1mL~-2mL固定液（甲醇：冰醋酸，3：1）混匀。以1500z/tain离心5min~7min，弃去上清液。10.3.3周定：加人5mL~7ml.固定液，混匀后固定10min~20min，以1500r/min离心5min~7min，弃去上清液。同法再固定1～2次，弃去上清液。10.3.4滴片：加人数滴新鲜固定液，混勺。将混悬液滴丁冰水预冷的载玻片上，自然十燥。10.3.5染色：将滴片用姬姆萨染液染色，晾干备用，10.4结果观察
在光学显微镜下每一试验组至少选择200个分散良好的中期分裂相（染色体数为2n土2）进行染色体畸变观察。应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录畸变类型。10.5推荐的观察项目
10.5.1染色体数目的改变
10.5.1.1非整倍休：亚二倍体或超二倍体。10.5.1.2多倍体：染色体成倍增加。10.5.1.3核内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。染色体结构的改变
断裂：损伤长度大于染色休的宽度。10,5.2.1
2裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。10.5.2.3
微小体：较断片小而呈圆形。
10.5.2.4有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。10.5.2.5无着丝点环：成环状结构。6单休互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。10.5.2.6
10.5.2.7双微小体：成对的染色质小体。3非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。10.5.2.8
11数据处理
结果数据宜包括细胞毒性（如细胞融合程度、细胞计数，有丝分裂指数等）、畸变细胞数、染色体畸变细胞的百分率、各剂量组及对照组不同类型染色体畸变数与频率等。应分别记录裂隙，但报告时，一般4
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不包括在总畸变频率中。采用X检验对结果进行统计学处理，以评价试验样品的致畸变性。12
结果判定
阴性对照组染色体畸变率在正常范围内（通常小于4.9%），否则应重新试验。出现以下两种情况之一时，可判定试验样品在本试验条件下具有致染色体畸变性：a）试验样品引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加。b）试验样品在任何一个剂量条件下可引起具有统计学意义并有可重复性的阳性反应。阴性结果表明，在本试验条件下，试验样品不具有致染色体畸变性。试验报告
试验报告中应包含下列信息：
试验样品名称、规格型号和批号：试验和对照样品制备方法
试验用细胞株来源及质量控制信息：试验条件和试验步骤；
试验结果；
结果评价；
结论。
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A.1大鼠肝S9液
附录A
（资料性附录）
S9和 S9混合液制备
A1.1选健康雄性成年SD或Wistar大白鼠，体重150g左右，约5~-6周龄。将多氯联苯（Aroclor1254）或苯凹比妥纳溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg（体重）无菌操作一次腹腔注射。注：也可采川萃巴比妥和β茶黄霸联合诱导。A.1.2第6天用颈动脉改m法处死动物，打开腹腔，用20mL新鲜冷至4℃的0.15mol/L氯化钟溶液进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出。取出肝脏称重后，用0.15ol/L氯化钾溶液连续冲洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋口。每克肝（湿重)加0.1mol/L氯化钾溶液3mL，连同烧杯移人冰济中，用灭菌剪刀剪碎肝脏，在玻璃勾浆器（低于4000r/min往复1min~2min），或组织匀聚器（20000v/min，1min）中制成肝匀浆，以上操作需注意无菌和局部冷环境( ℃)
A.1.3将制成的肝匀浆在低温（0~4C）高速高心机上，以9000g离心10min，吸出上清液为肝S9液。
A.1.4S9制成后经无菌检查，测定蛋白含量（Lawry法），每毫升蛋自含量宜不超过40mg，并经间接致瘾物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后，分装于无菌冷冻管或安丽中，每安额2ml.左右，用液氮或干冰速冻后置
80℃低温保存，保存期不超过
A.2S9混合液辅助因子
A.2.10.4mal/氯化美（MgCl）溶液：称取3.8g，加蒸馏水稀释至100mL。灭菌或滤菌。4℃保存。
A.2.21.65mol/L氯化钾（KCD溶液：称取12.3g，加热馏水稀释至100mL灭菌或滤菌。4℃保存。
A，2.30.2m0l/L磷酸盐缓冲液（PH7.4），每500mlL由以下成分组成磷酸氢二钠(Na,HPO,)(14.2g/500mL)磷酸二氢钠(NaH,PO..H,O)(13.8g/500 mL)440mL
调pII为7.4,0.103MPa,20min灭菌或滤菌。4℃保存。A.2.4辅酶-II（氧化型）溶液：准确称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L游液，低温保存（一20℃以下）。
A.2.5葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液：称取葡糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸留水溶解配制成0.05mol/L，低温保存（一20℃以下)。
A.310%S9混合液
每10mL由以下成分组成：
磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.4)氟化钾溶液（1.65mol/L）
氯化镁溶液（0.4ol/L)
葡萄糖-6-磷酸盐溶液（0.05ol/L)捕酶-T溶液（0.025mol/L)
肝S9液
临用时新鲜尤菌配制，或滤过除菌。混匀，置冰浴中待用。YY/T 0870.2—2013
YY/T 0870.2—2013
磷酸盐缓冲液
磷酸氢二钠(NazHPO,·12H,0)
磷酸二氢钾（KH,PO
附录B
（资料性附录）
试剂和培养液制备
溶于1000mL蒸馏水中，调pH为6.8,0.103MPa20min火菌或滤菌。4保存。B.2D-Hanks液
NazHPO
穿于1000mL蔡馏水中，.103MPa20min火菌或滤菌，4℃保存。3Ciemnsa储备液
取Giemsa染料：.8g，置研钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mL，溶解后再加125ml纯甘油，于37C温箱保温48h,在此期间播动数次，放置1周～2周过滤备用。B.4Giemsa应用液
取 1 ml.储备液加人 10 mL pH 7.4磷酸缓冲液,临用时现配。B.5
5固定液
甲醇（分析纯）：冰乙酸（分析纯）以3：1混合，临用时现配。6二甲基亚砜（DMSO)
光谱纯，0.103MPa20min灭菌。
鑫考文献
YY/T0870.2-—2013
［1]YY/T0127.16—2009口腔医疗器械生物学评价第2单元：试验方法
哺乳动物细胞体
外染色体畸变试验
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