【YY医药标准】 医疗器械遗传毒性试验 第3部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0870.3—2013
医疗器械遗传毒性试验
第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞
进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验Test forgenotoxicity of medical devices-Part 3: In vitro mammalian cell gene mutation test using mouse lymphoma cells2013-10-21发布
国家食品药品监督管理总局
2014-10-01实施
YY/T0870的总标题是《医疗器械遗传毒性试验》，包括以下部分：第1部分：细菌回复突变试验；
-第2部分：休外乳动物细胞染色体畸变试验；第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验；第1部分：哺乳动物骨髓红细胞微核试验；第5部分：哺乳动物骨髓染色体畸变试验，有关其他方面的遗传毒性试验将有其他部分的标推。本部分为YY/T0870的第3部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T0870.3-2013
YY/T0870的本部分是参考OECDNo.476(1997)《体外哺乳动物细胞基因突变试验》并结合医疗器械/材料自身特点制定的。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC.248)归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位：国家食品药品监督管理局北京医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管理局天津医疗器械质量监督检验中心。本部分主要起草人：曾冬明、刘成虎、王昕、王慈、袁厚。YY/T0870.3—2013
GB/T16886.3中给出的检测潜在遗传市性物质的试验方法均为经济合作与发展组织(OECD)《化学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定而成，同时未给出详细的试验步骤，因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T0870参照OECD试验方法基本原则，并根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为GB/T16886.3中遗传毒性试验的补充方法标准。
YY/T0870的本部分参照OECDNo.476（1997）方法，是在有或无代谢活化系统的情况下，通过医疗器械/材料诱导小鼠淋巴瘤细胞（L5178YTK+/—3.7.2C)基因正向突变情况，来评价试验样品潜在的致突变性。
YY/T.0870的本部分中根据在培养基中的牛长能力和自发突变率是否稳定选择细胞。体外进行的试验通常都需要用外源性代谢活化系统。但外源性代谢活化系统并不能完全模拟哺乳动物体内的代谢条件。PII和渗透压的改变或受试样品的细胞毒性较高等可导致假阳性结果，从而使试验结果无法反应体内基因突变的真实情况。1范围
医疗器械遗传毒性试验
第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞
进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验YY/T0870.3—2013
YY/T0870的本部分规定了使用小鼠淋巴瘤细胞株（15178YTK+/-3.7.2C)进行医疗器械/材料体外哺乳动物细胞基因突心试式验的方法本部分推荐的试验）法为微孔板法。注：口腔材料的体外哺乳动物细胞基因突变试验不包拓在本部分范围内。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注育期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件：GB/T 16886.1
医疗器诚生物学评价
16886.3医疗器械生物学评价
GB/T16886.5
医疗器械生物学评价
GB/T16886.12医疗器械生物学评价3术语和是义
GB/T16886.1GB/T16886.3租CB/T3.1
正向突变
forward mutation
部分，风险管理过程中的评价与试验第3部务：
传毒性效瘤性和生殖市性试验
第5部分：体外细胞毒性试验
第12部分：样品制备与参照祥品886
12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为从原型（野生型）转变至突变型的基因突变，可引起酶活性和编码蛋白的改变和丢失。3.2
突变频率mutantfrequency
为所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值3.3
相对存活率relative survival;Rs处理结束后，接种的处理细胞形成集落的效力，通常以与对照组细胞数的存活率比值表示。4主要设备
超净工作台、CO，培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡水浴箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器等。
5活化系统、培养基和试剂
试验用活化系统（S9和S9混合液）参见附录A，培养基和试剂参见附录B的规定制备或购买市售1
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商品。
6细胞株
6.1细胞株
推荐使用小鼠淋巴瘤细胞株（L5178YTK十/-3.7.2C)。经过传代培养后，细胞呈对数生长状态，但细胞持续培养最多不超过3个月。鉴于细胞性状稳定性要求，试验细胞株最好新取白冻存细胞。细胞在35℃～38振荡培养，增殖周期为10h左右。6.2细胞自发窦变清除
6.2.1应适时检查冻存细胞的自发突变频率。一般地，试验细胞株的平均自发突变频率在35×10-5~140×10范围内。当细胞突变率偏高时，按6.2.2～6.2.4对自发突变细胞进行清除。6.2.2将对数生长的细胞配制成2×105个/mL，加人100倍的THMG液，加人量为总体积的1%。置CO，培养箱（含体积分数5%COz，下同）培养24h。6.2.3培养24h后以200g离心5min，除去上清液，加入新鲜RPMI1640培养液，细胞浓度调整为2×105个/mL。加人100倍的TIIG液，加入量为总体积的1%。培养45h~48h，注意避免过度培养。6.2.4将培养后的细胞以200g离心5min，除去上清液后加入冻存液，细胞浓度调整为2×10°个/mLr~5×10个/mL。分装于冻存管中冻存。6.3支原体污染检测
在制备冻存细胞液之前以及准备丢弃过期的细胞之前进行支原体的检测，以保证在细胞培养周期中无支原体的污染。支原体污染的检测可以采用直接培养法或间接Ioechst染色法。6.4核型稳定性检测
宜道过检测平均染色休数日来判断核型稳定性，通常在细胞生长周期过程中和准备丢弃过期的细胞之前进行，以保证在细胞培养周期中没有发牛核型的变化。核型分析，包括染色体分带在制备冻存细胞液前进行。
7试验前准备
7.1器具灭菌
与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法火菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h
7.2试验环境要求
试验应在无菌操作台或超净工作台中进行。8样品制备
宜根据GB/T16886.12的原则制备试验液：可采用生理盐水和/或其他适宜溶剂作为浸提介质。浸提介质不应与试验样品发生化学反应，且应对细胞的存活和S9的活性无影响。如怀疑试验样品可能对本试验细胞株产生毒性作用时，应根据细胞毒性预试验的相对存活率来确定适宜的试验液浓度。2
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注1：ISO10993.3正在修订，当新的样品制各方法在未来标准中得到确认后即可来用。注2：若根据细胞毒性预试验的相对存活率进行剂盘设计，般在相对存活率为阴性对照组的10%~20%范围内确定最大细胞脑毒性浓度，对试验样品或漫提液进行梯度稀释至最小或尤细胞毒性，在相对存活率为闭性对照组的20%～80%范围内设至少四个剂量组。注3：与经典的化学物全身毒性试验不同，医用材料一般得不到LD的剂量值。若采用浸提液进行试验，可考虑单剂置组试验（即试验样品原液或100%的浸提原液），但宜对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。注4：高浓度的DMSO具有细跑毒性作用，因此，如采用TDMSO为浸提介质，使用时浓度应不大于1.0%（体积分数)。
9对照样品制备
9.1阴性对照
同批号试验材料浸提介质，不加试验材料同条件制备。9.2阳性对照
推荐无活化系统采用甲磺酸甲酯（methylmethanesulphoate，MMs），新鲜配制，浓度为10μg/mL；有活化系统采用7，12-二甲基苯葱（7，12-ditnethylbenz（a）anthracene，DMBA），浓度为2.5μg/mL。也可采用其他适宜的阳性对照品。10试验步骤
10.1预试验（如怀疑试验样品可能对本试验细胞株产生毒性作用时）10.1.1接触处理
取生长良好的细胞，调整细胞浓度为1×10°个/ml.。无活化系统组取10mL细胞悬液与9ml.试验或对照样品以及150mmol/L氯化钟溶液1mL混合；有活化系统组取10mL细胞悬液，加入9mL试验或对照样品以及S9混合液1mL。将上述各种混合液置于50mL带盖离心管中37C振荡培养4h，振荡率为70r/min~80r/min。10.1.20天的平板接种效率（PE,）平板将10.1.1混合液以200g离心5min，去除上清液，用无血清RPMI1610培养基洗涤细胞两次，用RPMI1640培养基梯度稀释至细胞数量为8个/mL，接种96孔板，每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为1.6个）。每种剂量接种两块平板。将平板放置于COz培养箱37℃培养11d~14d.10.1.3集落计数
目视或在显微镜及其他适宜用具下观察计数各平板无集落生长的孔数。10.1.4数据处理
按式(1)、式(2)计算PE。及RS。10.2主试验
10.2.1接触处理
同10.1.1。
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注：若未加S9组在接触4h后结果为阴性，宜延长至24h。10.2.2表达
将1述各种混合液以200g离心5min，去除上清液，用无血消RPMI1640培养基洗涤细胞两次。重新悬浮于RPMI1640培养基中，调整细胞浓度为3×105个/ml.,37℃培养2d，于24h时检查细胞浓度并调整为3×10个/ml.。
10.2.3平板制备
10.2.3.1PF%平板：取10.2.1接触处理后离心重品的细胞悬液梯度稀释至细胞数量为8个/mL，接种96孔板，每孔加0.2mL(即每孔平均细跑接种数为1.6个）。每种剂量接种两块平板。10.2.3.2第2天的平板接种效率（PE）平板：第2天表达增养结束后，取适量细胞悬液，按10.2.3.1所述方法按种96孔板，每种剂量接种两块平板。10.2.3.3TFT拮抗光板：第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞浓度为1×10*个/mL，加人TFT(三氟胸苷，终浓度为3g/mL)，混勾，接种96孔板，每孔加0.2mL(即每孔平均细胞接种数为2000个)。每种剂量接种两块平板。将全部平板放置于CO，培养箱37培养1d~14d。集落计数
日视或在显微镜及其他适宜用具下观察计数各平极无集落生长的孔数。考试验组结果为阳性，宜至少记录晨高浓度阳性组以及明性对照和阳性对照的集落大小。若试验组结果为阴性，宜记录阴性对照和阳性对照的集落大小。变集落按大集落（LC.真名学1/4孔径足薄层分布，密度低和小集落（SC：直径<14孔径，呈快状，商度高）分别计数·极小集落可再继续培养3d后计数。数据处理
11.1平板效率（PE。和PFz）
按式(1)分别计算PE。和PE。
-In(EW/TW)
式中：
平板效率，PE。或PF，
一无集落生长的孔数；
一平板总孔数；
一每孔接种细胞数。
11.2相对存活率
按式(2)计算相对存活率。
式中：
RS相对存活率；
PE。一试验样品组PE。平板效率；PEob—阴性对照组PE。平板效率。PE
·（1)
11.3TFT抗性突变频率（MF)
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按式（3)分别计算大集落突变频率（L-MF）、小集落突变频率（S-MF)和总突变题率（T-MF）［-In(EW/TW)I/N
式中：
MF—-TFT抗性突变频率，X10-，EW—无集落生长的孔数；
TW-—平板总孔数；
—每孔接种细胞数，2000；
PE一-第2天的平板接种效率。
注：当计算L-MF和S-MF时，FW分别指无人集落生长和无小集落生长的孔数。11.4小集落突变率（SCM)
按式(4)计算小集落突变率(SCM)。S-MF
7-MF×100%
式中：
12结果评价
小集落突变频率；
总突变频率。
-（3）
当阴性对照的PE。在60%～140%范用内，PE，在70%~130%之间，或在各实验室历史数据范用内，而且阴性对照的T-MF小于本实验室历史记录的2倍（或<240×10-\），小集落突变率在30%~～60%范围内；阳性对照T-MF与阴性对照有显著差异，或比阴性对照高100×10-以上，则试验有效。否则应重新试验。
在试验成立的前提下，试验样品各剂量组T-MF出现有统计学意义的剂量反应性增长，或至少有一个剂量组T-MF与阴性对照有显著差异，或比阴性对照高100×10-\以上并具重现性，为阳性结果。13试验报告
试验报告中应包含下列信息：
试验样品名称规格型号和批号；a)
试验和对照样品制备方法及说明；b)
c）试验用细胞株来源及质量控制信息；d）试验条件和试验步骤；
e）试验结果；
结果评价；
g）结论。
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A.1大鼠肝S9液
附录A
(资料性附录）
S9和S9混合液制备
A.1.1选健康雄性成年SD或Wistar大白鼠，体重150g左右，约5~-6周龄。将多氯联米（Aroclor1254)溶于玉米油中，浓度为200mg/mL，按500mg/kg(体重）无菌操作一次腹腔注射：注：也可采川苯巴比妥和β茶黄葡联合诱导。A.1.2第6天用颈动脉放血法处死动物，打开腹腔，用20mL新鲜冷至4℃的0.15mol/L氯化钾溶液进行肝门静脉灌注后，小心分离并将肝脏完整取出。取出肝脏称重后，用0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加0.1mol/L氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用灭菌剪刀剪碎肝脏，在玻璃勾浆器（低于4000r/min，往复1min~2min），或组织匀浆器（20000r/min，1min）中制成肝勾浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境(4℃)。
A.1.3将制成的肝匀浆在低温（o℃~4℃）高速离心机上，以9000g离心10min，吸出上清液为肝S9液。
A.1.4S9制成后，经无菌检查，测定聋白含量（Lowry法），每毫升蛋白含量宜不超过40mg，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后，分装于无菌冷冻管或安中，每安部2mL左右，用液氮或干冰速冻后置一80℃低温保存，保存期不超过1年。A.2S9混合液辅助因子
A2.10.1mol/L氯化镁（MgCl.）溶液：称取3.8g，加蒸馏水稀释至100mL。灭菌或滤菌。4℃保存。
A.2.21.65mol/L氟化钾（KCl)溶液：称取12.3g，加蒸馏水稀释至100ml。灭菌或滤菌。4℃保存。
A.2.30.2mol/1.磷酸盐缓冲液（pH7.4），每500mL由以下成分组成：磷酸氧二钠（(Na.HPO.)(14.2g/500mL）磷酸二氢钠（NaH，PO·HzO)(13.8g/500mL)440mL
调pH为7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌，4℃保存。A.2.4辅酶-I（氧化型）溶液：准确称取辅酶-IⅡ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，低温保存（—20℃以下)。
A.2.5葡萄糖-6-磷酸钠热溶液：称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用无菌蒸馏水溶解配制成0.05Mo1/L，低温保存（—20℃以下）。
A310%S9混合液
每10mL出以下成分组成：
磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.4）氯化钾溶液（1.65mol/L）
氯化镁溶液（(o.4mol/1.)
葡萄糖6-磷酸盐溶液（0.05mol/L)辅酶Ⅱ济液（0.025mol/L)
肝S9波
临用时新鲜无菌配制，混勾，置冰浴中待用。0.2ml
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YY/T0870.3—2013
B,1 磷酸盐缓冲液
磷酸氢二钠(NazHPO·12H,0)
磷酸二氢钾（KHPO）
（资料性附录）
试剂和培养液制备
溶于1000mL蒸馏水中，调pII为7.4,0.103MPa20min灭菌或滤菌。4℃保存。B.2二甲基亚砜(DMSO)
光谱纯，0.103MPa20min灭菌，
B.3THG溶液（100倍）
胸腺嘧啶核苷
次黄嘌岭wwW.bzxz.Net
甘氮酸
以上成分用100mL无血清RPMI1640培养基溶解后过滤除菌，一20℃保存。B.4THMG溶液（100倍）
按下列步骤配制：
a）配制氨甲碟呤溶液（1000倍）：间避光的容器中加人3.0mg氨甲赚岭、19.45mL质量浓度9g/L的氯化钠溶液、1mol/L氢氧化钠溶液0.35mL，溶解后加I人1mol/L盐酸溶液0.2mL；配制THMG溶液（100倍）：取上述氮甲噪岭溶液0.55mL，加入按B.3制备的THG溶液b）
4.95tmL，过滤除菌。
版权专有偿权必究
书号：155066-2-26369
YY/T0870.3-2013
打印口期：2014年5月16几F053
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