【YY医药标准】 医疗器械补体激活试验 第1部分:血清全补体激活

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0878.1-2013
医疗器械补体激活试验
第1部分：血清全补体激活
Test for complement activation of medical devices-Part 1:Serum whole complement activation2013-10-21发布
数码防为
国家食品药品监督管理总局
2014-10-01实施
YY/T0878的总标题是《医疗器械补体激活试验》，包括以下部分：-第1部分：血清全补体激活；
第2部分：替代途径补体激活：
第3部分：经典途径补体激活。免费标准bzxz.net
有关其他方面的补体激活试验将有其他部分的标准。本部分为YY/T0878的第1部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。YY/T 0878.1—2013
YY/T0878的本部分参考ASTMF1984—1999固体材料血清内全补体激活试验的标准规范》制定。
本部分与ASTMF1984—1999相比，存在以下差异：一对ASTMF1984一1999进行「编辑性修改，删除了部分不适用的资料性内容；增加了前言部分：
增加了附录A试剂和缓冲液制备。请注意本文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248)归口。本部分主要起草单位：国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心。本部分参加起草单位：上海生物材料研究测试中心；中国医学科学院输血研究所。本部分主要起草人：齐春、王科铺、刘成虎、丁婷婷、孙咬、王红。YY/T0878.1—2013
GB/T16886.4中给出了医疗器械/材料血液相容性的试验力法以及试验的选择策略，但只给出了选择原则。YY/T0878的本部分是体外全补体激活作用的具休试验方法，可作为GB/T16886.4中医疗器械/材料补体激活试验的补充。作为血液的重要组分，补体系统激活后产生的效应分子将直接影响医疗器械/材料的血液相容性。补体不适当的激活可能会导致机体的严重急/慢性反应。YY/T0878的本部分所描述的体外全补体激活作用的评定方法，可用来筛选医疗器械/材料是否具有潜在补体激活作用。1范围
医疗器械补体激活试验
第1部分：血清全补体激活
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YY/T0878的木部分给出「医疗器械体外全补体激活作用的试验方法，本方法适用于固态样品。本部分中，“血清”和“补体”可通用，意指将血清用作补体来源本部分未涉及单一补体成分的功能、修饰或消耗以及来源于血浆的补体。注：非固态样品在使用本方法时宜确定方法的适用性，2规范性引用文件
下列文件对丁木文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用丁本文件。凡是不连日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分，风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.4医疗器械生物学评价3术语和定义
第4部分
与血液相丘作用试验选择
GB/T168851、GB/T16886.4界定的术语和定义适用手本文件4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ab：抗体（溶血素）
BBS:巴比妥缓冲液
BBSG巴比要缓冲液-明胶
BBS-GM：巴比妥缓冲液钙镁离子明胶C：已激活补体
EDTA：乙二胺四乙酸二钠盐二水合物HS：人血清
PVDF:聚偏氟乙稀
RBC:红细胞
5绵羊RBC的制备
5.1将市售的缔羊红细胞（SRBC)保存在Alsever溶液中，4℃贮存。贮存超过8周或者日测检查第二次清洗的上清液当中有血红蛋白时，将细胞废弃。注：所有离心操作均在4℃条件下进行。除特别说明，所有的试剂、试管和细胞制剂均在冰上保存。5.2将5mlSRBC在1000g下离心10min。1
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5.3将细胞沉淀悬浮于10mL冷RBS-G-EDTA中,37℃孵育10min。离心并使细胞沉淀重新悬浮于10 mL.冷BBS-G-EDTA中。
5.4细胞离心后，将上清液废弃（首次清洗），并使细胞沉淀重悬于10mL冷BBS-GM中。重复进行两次（共计3次清洗）。
5.5通过分光光度计或血綫分析仪的测定，用冷的BBS-GM工作液调配得到10mL浓度为1.5×10°个/mL的BBSGMSRBC悬液（如用分光光度计进行调配，约1体积上步制备的细胞悬液加入24体积BBS-GM工作液，在412nm波长下，光径为1.0cm，吸光度为0.56相当于1.5×10个/mL的细胞浓度)。
5.6经过清洗、稀释的RBC冰上放置，至少可使用12h。6血清(补体）的吸收
6.1宜使用人类补体，因为不同物种补休激活效能存在差异，而且试验材料将被应用于人体。人血清作为补休源的一种，可从生物制品供应商处购买，并且一胶标示为试剂级补体。6.2为去除人血消中自然产生的抗SRBC溶血抗体，可采用SRBC吸附人血清异嗜抗体的方法，虽然大多数情况下，如果细胞用溶血素进行最佳致敏，人血清中异嗜抗体的数量不足以影响两者之间的反应。详细步骤见6.3~~6.8。
6.3新鲜人血清或市售的人血清均在一70C贮存，最好使用新鲜血清，因为冻干剂的补休活性一般不如新鲜血清。
6.4而清在冰上解冻，或用冷(4℃）的无内毒素的蒸馏水复溶（若为冻干剂）。6.5为避免本步骤中补体被激活，所有操作均在冰上进行，且试剂和细胞均冰冷处理，4℃条件下以1000g进行离心。
6.6按0.1mLRBC/2.5mL血清的比例，将冷血清与冷的，已清洗的压积绵羊RC混合，冰上孵育10min后，4℃条件下1000g离心10min。小心地将上清液转移到一个新的、冰上放置的容器中。6.7重复6.6的步骤两次。
6.8将吸附后的人血清按0.5ml～1.0mL等分试样（便于一次试验使用）贮存在冷的、带锁扣盖的微量离心试管内，一70℃保存直到使用。等分试样宜在冰上解冻，且在解冻当日使用，并不宜再次冷冻。
7最佳溶血素浓度的测定
7.1为了节省贵重试剂和避免前带效应，最佳溶血素的浓度测定是必要的。购买的市售抗绵羊RBC的免血清（溶血素）解冻后，或用无内毒素的蒸馏水复溶（若为冻干剂）后，在56℃条件下热灭活30min，并等分成适宜体积，一70℃贮存古到使用。7.2将Φ13mm×100mm次性玻璃试管，放置在冰中的试管架上，加人0.1mL，浓度为1.5×10细胞/mL的已清洗绵羊RBC。如需要对试验结果进行统计学分析，则每种条件下宜采用3支相同试管。否则，两支甚至单只试管就足够了。仅向一组3支相同试管巾加人0.1mL冷BBS-GM（无RBC对照，作为补体背景颜色）。
7.3对盛有RBC的试管，向一组3支试管中分别加入1.1mL冷热馏水（完全裂解对照），向另一组中加入0.1mLBBS-GM(无溶血素对照),其余各组试管中分别加入0.1mL1：2系列稀释的溶血素（试验）。推荐抗体稀释度在1/400与1：25600之间。向无RBC对照试管中再加入0.1mLBBS-GM7.4轻微摇动每支试管，快速混合重新悬浮细胞，将试管架放置在37℃水浴，孵育10min，然后再放回到冰浴中。
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7.5向两组加入抗体试管的一组中加人1.0mL冷BBS-GM（无补体对照）。除全部裂解对照组试管外，向其余所有试管中加入0.5mL冷BBS-GM，然后再加人0.5mL稀释至1：100或1：200的吸附过的人血清(补体)。
注：对于特定量的人血清，1：100或1：200稀释度宜提供足够的补体活性。同时，无路血素（只有补体）对照组中的裂解分率宜不超过10%。若1：100稀释度的补体中的裂解口分率超过10%，则采用1：200的稀释度。若无溶血素对照组仍超过10%时，则需要用不同量的血消进行试验。7.6手工摇动试管悬浮细胞，然后将试管架放置在37℃的水浴中孵育1h，间歌性摇动试管，使细胞保持在悬浮状态。
7.71h后，将试管架置于冰上，然后将冷的试管在4℃条件下1000g离心10min，将上清液轻轻移入相应编号的13×100mm玻璃试管中。7.8在112nm波长处测量上清藏的吸光度。每支试验管和对照管的裂解百分率的计算是用其在412nm处的吸光度减去无RBC对照的吸光度（指3支相同试管的平均值），然后除以完全裂解对照值（指3支相同试管的平均值），再乘以100%，见式（1)。试验吸光度一无RBC对照吸光度×100%裂解百分率一
全部裂解吸光度
7.9每种条件的最终裂解百分率表示为每组3支相同试管的3个裂解百分率的上SD。-（1)
7.10绘制特异性裂解百分率与对应的溶血素浓度倒数的滴定曲线。在滴定曲线的平稳段取刚进人平台区溶血素浓度的两倍浓度值，用于随后的致敏RBC测定（最佳溶血素浓度）。每次使用前将贮存的溶血素重新稀释。
8全补体滴定测定最佳血清稀释度8.1若需要对结果进行统计学分析，则在每种条件下，宜用3支13×100mm的一次性玻璃试管对全部条件重复测定3次。否则，两支甚至单支试管就足够了。试管提前进行编号，条件包括完全裂解、无补体（无C\）、带有和不带有溶血素的试验组（稀释人血清HS)以及无RBC(使用最高浓度血清的补体背景颜色对照）。所有试剂、试管和操作均在冰冷条件下，试管架上的试管放置于冰浆中。8.2除无RBC的试管以外，将消洗过的RBC加入所有试管(0.1mL/管的1.5×10\细胞/mL悬浮液）。无RBC试管中加人0.1mL冷缓冲液。8.3向完全裂解试管中加人1.1mL蒸馏水。向无C的试管中和带有溶血素的试验管中加人0.1ml最佳浓度的溶血素（见7.10)，向无RBC试管中加入0.1mL冷BBS-GM。摇动所有试管，重悬细胞，在37℃水浴中孵育10min后，重新放回到冰上。注：也可制备一大批川于一周所有试验计划的溶血素致敏的红细胞。上述细胞按5×10°/mL的浓度制备，4℃存放，每饮使用前进行清洗，若发生溶血，则制备新的致敏纠胞。使用这些效敏细胞，无需再向各个试管中添加溶血素，从而简化试验。未致敏的RBC可用作非特异性裂解的对照。8.4除了完全裂解试管之外，将最大体积为1.0mL的冷B313S-GM加入所有试管中，并加入最大体积0.5mL的稀释血清（见8.5)进行还原。向无C试管中加人1.0mLBBSGM。8.5冷血清用冷BBS-GM稀释至所需浓度（具有最小激活作用）。建议在1：50～1：300之间先进行HS测试。向除了完全裂解试管和无C试管以外的所有试管中加人0.5mL稀释血清，宜用BBS-GM将每支试管的终体积加至1.2mL。8.6试管按7.6~7.9中所述进行处理。8.7特定量人血清的最佳稀释度确定为非特异性裂解（HS1RBC,尤血素抗体）≤10%，而特异性裂解在20%~80%之间[全部裂解（RBC十Ab+HS)减去非特异性裂解.即：特异性裂解在补体滴定曲线的直线段。试验中大量吸附的人血清的典型最佳稀释度为1：200，体积为0.5mL。3
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9步骤A—材料与人血清接触
9.1粉末
注1：用醋酸纤维素作为粉未的实例。用典型的台式临床离心机进行离心不足以将与补体共同孵育的粉未制成球状。因此，需要进行过滤操作，同时需要加做适当的对照。将冷的已吸附的人补体放入冰上放置的?13mm×100mm一次性玻璃试管的底部，9.1.1
0.1mL/试管。测定过程最少需要4只试管，分别标为M（材料）、NM（无材料对照）.I（冰1，过滤对照），1（冰2，最大补体活性对照），注2：其他对照可能包括兵有相同单位表面积，或其他相似的材料或具有补体活化作用的阳性对照的其他材料间的比较，如：酵母聚糖，或热凝集内种球蛋白(HAGG)或其组合体9.1.2将M和NM试管的上半部分用手加热，避免粉未因润附着在试管堂。将确定数量的粉末加人试管底部0.1m的血清中，如6mg粉未，使其刚好被液体浸没。在不混合的情况下，将两支试管放人37℃的水浴中，孵育1h。1,和I2仍放在冰上。9.1.3准备3支针筒式过滤器，建议采用低蛋自结合的过滤器，如：0.22μm孔径的亲水性PVDF膜。每只过滤器用2.0m冷BBS-GM进行冲洗，并用空气排出残留液体，放置在冰上的架子上待用。9.1.41h的孵育结束时，将M和NM试管重新放回到冰上，立即向每支试管中加人4.9mL冷BBSGM(1：50稀释的接触血清），吹吸混匀，确保血清与缓冲液的充分混合9.1.5将试管在4C条件下2000g高心10min。吸取ml液体，并通过单独的、装配好的0.22μm针筒式过滤器过滤幸另一个新的冷试管中。9.1.6然后将每支试管中的内容物在冷试管中稀释至最佳人血清希释度（见8.7)，并放置在冰上。宜在1h内测定通清的补体活性（见第10章）9.2纤维或片状固体
9.2.1固体纤维或片状材料对全补体激活作用的测定方法与9.1中粉末采用的方法基本相同，不同的是：确定数量的纤维或材料（mg量，刚好被0.1mL血清完全浸没)首先放置在室温中的13mm×100mm试管小，然后向MNM和Iz试管中加人0.1mL血清，并立即将M和M试管放人37℃的水浴中，I和I，放置在冰上，将M和NM试管放置1h后，立即从7C水浴取出，同样政置在冰上。9.2.2若供试材料不漂浮，或2000g离心后能形成坚固的球状体时，则可略去过滤步骤和I对照。9.3测定规模和供试条件
9.3.1上述常规设计方案可对不同量的材料进行试验，形成剂量效应曲线，或对等量材料在37℃条件下的不同时间点的反应（时间进程）进行试验，或比较不同材料间的C激活作用。注：当材料的人小或形状无法在13mm×100mm的-次性玻璃试管中进行试验时，与材料接触的血清也可以不是100pL
9.3.2山于对每一条件来说，宜测定其特异性溶血%，因此需测定全溶血%（Ab十RBC十HS)和非特异性溶血%（RBC+HS），且每种条件测定3次，同时建议每个技术人员一次试验测定试验样品的总数不超过10个（从而不超过约100只试管的最终测定规模）。10步骤B—补体缺失的血清测定
10.1步骤B用于测定先前已与材料接触的血清（步骤A)的全补体活性的可能消耗情况。YY/T0878.1-2013
10.2所有条件均测定3次，每种条件下采用3支13mm×100mm一次性玻璃试管。试管提前进行缩号。所有条件包括完全裂解、无补体（无C）、带有和不带有溶血素（每组3支试管）的试验组（稀释人血清-HS)以及无RBC(最高浓度血清）。所有试剂、试管和操作均在冰冷条件下进行。10.3加入已清洗的RBC，然后按8.2和8.3的要求加人溶血素。10.4向无C试管中加人1.0mLBBS-GM，除“完全裂解”试管以外，向其余全部试管中加人0.5mL冷BBS-GM，然后从材料与血清接触步骤中的试验试管或对照试管中各取0.5L冰中存放的稀释至最佳浓度的人血清（见8.7），分别加人到3支装有溶血素致敏RBC的试管中，同时分别加人到3支装有未致敏RBC的试管中。
10.5然后将试管按7.6～7.9的步骤进行处理。11
试验结果和数据分析
11.1与保存在冰中的血清（1.）相比较，37℃时对不与材料接触的血清（NM试管）进行孵育，可能会导致补体溶血活性的降低。若需要过滤时（冰1试管作为对照，I），也会在I，中看到补体溶血活性比I显著降低。
11.2步骤A中宜至少对材料进行3次重复试验，并对得到的3支接触试管，在步骤B中分别进行3次重复测定。这样做的月的，在于证明造成显著差异的原因在于不同条件的作用方式不同，而非试管间的测量误差：若存在微小差异时，则需将步骤人中每一条件下重复制备的试管数量增至5管或更多。11.3步骤B中对照溶血活性的显著消耗表明步骤A中试验材料对全补体的激活作用。11.4使用适当的统计学方法进行分析，如：方差分析（ANOVA），当力≤0.05时，认为有显著的落血差异。可用条线图表示每一条件下的平均值和标准偏差。YY/T0878.1—2013
A.1试剂
附录A
(资料性附录）
试剂和缓冲液制备
Alsever溶液：葡荷糖2.05g.柠檬酸钠0.80g，NaCl0.42g，溶于100mL双蒸水中。A,2缓冲液
A.2.1缓冲液，推荐使用巴比妥（佛罗钠）缓冲液。也可以采用已被证明不会激活补休的其他缓冲液体系，如TRIS。“水”全部是指无内毒素的蒸馏水。A.2.25×BBS贮存液（巴比妥缓冲液）将20.75gNaCI和2.545g凹比妥钠（5，5-二乙基巴比酸钠）加人约400mL水巾制备。用1mol/LHCl调整pH至7.35，然后在容量瓶中加至最终体积为500ml
A2.3钙离了溶液，将2.0mol/LMgCl,溶液（将40.66gMgCl·6H,0加入100mL无内毒素的蒸馏水中）和0.3mol/LCaCl溶液（将1.11gCaClz·2HO加人100mL无内毒素的蒸馏水中）按1：1(体积比)的比例混合制备，这些溶液可在4℃稳定存放一个月。A.2.41313S-GM工作溶液，需使用前新鲜制备，将0.25g明胶人50mL无内毒素的蒸留水中，轻微加热并搅拌。将明胶溶液加人50tmL5×BBS贮存液和0.25mL钙镁离子溶液中，加水至约200ml.调整pH（使用1mol/LHCl或1mol/LNaOH）至7.35，然后在容量烧瓶中加水至最终休积为250mL
A.2.513B3S-G工作溶液，制备方法同上，但不加人钙镁离子溶液。A.2.610XEDTA忙存液(0.1mol/LEDTANaz2HO)，将7.44gEDTANa2H,0加160ml水中，调整pH（使用1mol/LNaOH或1mal/LHCl）至7.65，然后在容量烧瓶中加水至休积为200mL.
A.2.7BRS-G-FDTA（用于清洗前制备RBC)，在容量烧瓶中将10mL10×EDTA存液加入90mLBBS-G溶波中。
参考文献
YY/T0878.1—2013
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[2J Gee, A.P.,“Molccular Titration of Components of the Classical Complenent Pathway,\Meth-ods in Enzymology,Vol 93, Immunochemical Techniques, cds J.J.Langane, II.V. Vunakis, Aca-demiePress，1983pp.339-375
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