【YY医药标准】 组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法

ICS_11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1453—2016
组织工程医疗器械产品
I型胶原蛋白表征方法
Tissue engineering medical device products-Methods for determination of type I collage2016-07-29发布
国家食品药品监督管理总局
2017-06-01实施
2规范性引用文件
3术语和定义
4I型胶原蛋白性能测试方法
附录A（规范性附录）I型胶原蛋白纯度测定附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
附录D（规范性附录）
附录E（规范性附录）
羟脯氨酸含量测定
熔点测定
微量元素分析
总糖含量测定
GB/T1453—2016
HiiKAoNni KAca
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本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。GB/T1453—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。与本标准中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：GB/T16886.1一2011医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验(ISO10993-1.2009,IDT)。
本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会(SAC/TC110/SC3)归口。
本标准起草单位：中国食品药品检定研究院。本标准主要起草人：柯林楠、方玉、付步芳、王健、黄元礼、段晓杰、陈丹丹、冯晓明、王春仁。HiiKAoNni KAca
HiiKAoNniKAca
1范围
组织工程医疗器械产品
工型胶原蛋自表征方法
GB/T1453—2016
本标准规定了用于制备组织工程医疗器械产品的工型胶原蛋白的测试方法。本标准所规定的工型胶原蛋白包括由动物的组织（如皮肤，肌腱，骨骼等）中提取，分离及纯化后得到的或其他来源得到的工型胶原蛋白。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.11一2014食品安全国家标准食品中总砷及无机碑的测定GB5009.17-2014食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（ISO10993-1，IDT)
GB/T22223一2008食品中总脂肪、饱和脂肪（酸）、不饱和脂肪（酸）的测定水解提取-气相色谱法
中华人民共和国药典（2015年版）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
type I collagen
I型胶原蛋白
由编码α链的COL1A1基因和COL1A2基因表达的，哺乳动物组织中含量最丰富的胶原蛋白，属于纤维型胶原蛋白。
注1：I型胶原蛋白的肽链由重复出现的甘氨酸-X-Y(脯氨酸经常占据X位，羟脯氨酸占据Y位)氨基酸序列组成。I型胶原蛋白富含甘氨酸（Gly），L-丙氨酸（L-Ala），L-脯氨酸（L-Pro）和4-羟脯氨酸（4-Hypro），硫含量较低，且不含L-色氨酸(L-Try）。
注2：胶原蛋白具有3条a链形成的三螺旋结构。加热情况下（例如，60℃以上）胶原蛋白a链三螺旋结构会不可逆变性成单一的。链和某些β和条带（即明胶)。注3：常与I型胶原伴随的有Ⅲ型胶原和V型胶原，此外还有非胶原类蛋白如弹性蛋白以及其他结构性分子（氨基多糖类、脂蛋白及糖蛋白复合物等）。3.2
外源因子adventitious agents
存在于I型胶原蛋白中的污染物，包括细菌、真菌、支原体和外源性病毒。这些物质可能会不经意地被引人生产工艺过程和终产品中。1
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GB/T1453—2016
杂蛋白protein impurity
杂蛋白是指在胶原蛋白纯化过程中残留的除工型胶原蛋白外的其他蛋白质。主要包括（但不限于）：弹性蛋白、未正确排列的胶原分子、宿主细胞污染物、酶制剂等。注：可能伴随I型胶原的Ⅲ型胶原不作为杂蛋白考虑。4型胶原蛋自性能测试方法
4.1鉴别
按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部0541电泳法第四法规定的方法进行，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为7%，加样量应不低于20μg，比较样品、I型胶原蛋白对照品经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后的谱带。4.2I型胶原蛋白的纯度
4.2.1I型胶原蛋白占总蛋白比例按照附录A中的方法进行。
4.2.2杂蛋白
按照附录A中的方法进行。
注：鉴于目前胶原蛋白酶的特异性，这里的杂蛋白是指非胶原蛋白类的蛋白。4.3胶原蛋白含量
I型胶原蛋白原料经干燥恒重后，精密量取供试品（约相当于含氮量1.0mg~2.0mg），按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部0731蛋白质含量测定法第一法规定的方法进行，得到样品中总蛋白含量，结果以干重计。
胶原蛋白含量（%）=样品中总蛋白质含量（%）×纯度4.4
羟脯氨酸含量
按照附录B中的方法进行。
4.5肽图
按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部3405肽图检查法第一法规定的方法进行。注：由于胰蛋白酶对天然胶原蛋白几乎没有作用，但可以降解变性的胶原蛋白。应将样品进行热变性后，再用胰蛋白酶进行处理，并保证胶原蛋白有足够的降解率，4.6熔点
按照附录C中的方法进行。
4.7炽灼残渣
按照《中华人民共和国药典》（2015年版0841规定的方法进行。2
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4.8重金属总量和微量元素
4.8.1重金属总量（以Pb计）
GB/T1453—2016
取炽灼残渣项下遗留的残渣，按《中华人民共和国药典》（2015年版）0821重金属检查法第二法进行。
4.8.2微量元素
铬（Cr）、镉（Cd）、铜（Cu）、铅（Pb）、钼（Mo）、铁（Fe）、镍（Ni）、碑（As）、汞（Hg）按照附录D中的方法或等效的方法进行。
4.9酸水解产物
按照附录B中的第二法，制备样品酸水解检验液，通过氨基酸分析仪来测定I型胶原蛋白酸水解最终产物中的氨基酸组成。
4.10总糖含量（以葡萄糖计）
按照附录E中的方法进行。
4.11脂肪含量
称取干燥恒重的样品0.1g~5g（约含脂肪100mg～200mg），移人到250mL烧瓶中，加人约100mg焦性没食子酸和十一碳酸甘油三酯内标溶液2mL，加人几粒沸石，再加人2mL95%乙醇，混匀。然后加人8.3mol/L盐酸溶液10mL，混勾。将烧瓶放人70℃～80℃水浴中水解40min。每隔10min振荡下烧瓶，使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混人溶液中。水解完成后，取出烧瓶冷却至室温。最后加人10mL95%乙醇混匀。按照GB/T22223一2008的方法对样品中的总脂肪含量进行测定，结果以样品干重计。
4.12生物学性能
4.12.1无菌或微生物限度
无菌按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部1101无菌检查法规定的方法进行。微生物限度按照《中华人民共和国药典》（2015年版）1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法规定的方法进行。4.12.2细菌内毒素
按照《中华人民共和国药典》（2015年版）四部1143细菌内毒素检查法规定的方法进行。4.12.3生物学评价
应按GB/T16886.1的要求对I型胶原蛋白进行生物学评价。3
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GB/T1453—2016
A.1原理
附录A
（规范性附录）
I型胶原蛋白纯度测定
利用胶原蛋白具有其他蛋白质所没有的三股螺旋结构，配合特异性的胶原蛋白酶作用，通过考马斯亮蓝对牛血清白蛋白（BSA）染色极限的确定，检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白总量。A.2仪器与试剂
A.2.1仪器
A.2.1.1天平。
A.2.1.2电泳仪。
A.2.1.3影像分析系统。
A.2.2试剂
除特别注明者外，所有试剂均不低于分析纯。A.2.2.1细菌胶原酶。bZxz.net
A.2.2.2牛血清白蛋白标准品（BSA）。A.2.2.3胶原蛋白对照品（应根据种属来源，选择胶原蛋白对照品）。A.2.2.4胶原酶消化液：用20mmol/L磷酸二氢钠溶液（pH7.4，内含0.1mmol/L氯化钙）溶解胶原酶，配成含适当活性单位的胶原酶消化液（例如1.25U/mL）。A.2.2.5样品缓冲液（2×）：分别量取0.5mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液2.5mL、甘油2.0mL10%十二烷基磺酸钠4.0mL，0.1%溴酚蓝0.5mL，加超纯水稀释至10mL。A.2.2.6电泳缓冲液5×）：称取三羟甲基氨基甲烷15.1g、甘氨酸72.0g、十二烷基磺酸钠5.0g、加超纯水稀释至1000mL，使用前稀释5倍。A.2.2.7考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝R2501g，加人甲醇200mL、冰乙酸50mL、超纯水250mL，混匀
A.2.2.8考马斯亮蓝脱色液：量取甲醇400mL，冰乙酸100mL与超纯水500mL，混勾。A.2.2.9分离胶：浓度7%。
A.2.2.10浓缩胶：浓度4%。
A.3测定
A.3.1考马斯亮蓝对BSA的染色极限分析A.3.1.1BSA溶液配制：用水将BSA稀释成梯度浓度，浓度在0.001mg/mL0.025mg/mL。A.3.1.2SDS-PAGE分析：取各浓度BSA溶液20μL上样进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后用影像分析系统对脱色后的胶片进行分析，确定考马斯亮蓝对BSA的染色极限。4
A.3.2样品中杂蛋白分析
GB/T1453—2016
A.3.2.1样品a：用3%的乙酸或0.01mol/L的盐酸溶解样品，使蛋白浓度为1mg/mL。A.3.2.2样品b：用胶原蛋白酶消化液溶解样品，配成蛋白浓度与样品a相同，于37℃水浴作用4h。A.3.2.3样品c：取超纯水加胶原蛋白酶消化液，使胶原蛋白酶的浓度与样品b中的浓度相同。A.3.2.4上样分析：将上述样品与2X的样品缓冲液等体积混合（若溶液变成微黄色，需用NaOH溶液调成蓝色）后，置于90C～100C热水中1min～2min取出进行SDS-PAGE电泳。样品、BSA（取染色极限量）和分子量标准品上样体积均为20L，电泳电压110V。电泳结束后用影像分析系统对脱色后的胶片进行分析，记录条带光密度。A.4
结果计算
纯度计算
当B一C0时，按式（A.1)计算：
样品中胶原蛋白纯度（%）=A一（B—C）A.4.1.2
当B一C=O时，按式（A.2)计算：样品中胶原蛋白纯度
杂蛋白含量计算
杂蛋白含量按式(A.3)计算：
10000-BSA极限值
样品中杂蛋白含量（%）=100%一胶原蛋白纯度式中：
A-一样品a所有条带光密度之和，%；B——样品b所有条带光密度之和，%：C一样品c所有条带光密度之和，%。.(A.1)
..（A.2)
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B.1原理
（规范性附录）
羟脯氨酸含量测定
方法一紫外分光光度法测定样品中羟氨酸的含量羟脯氨酸是胶原蛋白中含有的特异性氨基酸，且含量比较稳定。将试样在105℃C和c（HCI）=6mol/L盐酸作用下，水解成羟脯氨酸，羟脯氨酸经氯胺T氧化后，与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在波长560nm处进行比色测定。B.2
2仪器与试剂
B.2.1仪器
B.2.1.1天平。
紫外分光光度计。
B.2.1.3恒温箱。
B.2.2试剂
除特别注明者外，所有试剂均为分析纯。B.2.2.1L-羟脯氨酸对照品：国家对照品。B.2.2.2盐酸溶液，c(HCI)=6mol/L：将优级纯盐酸与水等体积混合。B.2.2.3pH=6.0缓冲液：称取57g三水合乙酸钠、37.5g柠檬酸三钠、5.5g一水合柠檬酸，385mL异丙醇，加水500mL，用一水合柠檬酸调节pH至6.0，加水稀释至1000mL。B.2.2.4氯胺T溶液：称取3.5g氯胺T，加水稀释至50mL，现用现配。B.2.2.5氧化剂溶液：将加氯胺T溶液和pH=6.0缓冲液按1：4的比例混合。60%高氯酸溶液：量取高氯酸43mL，加水稀释至50mL。B.2.2.6
对二甲氨基苯甲醛溶液：称取10g对二甲氨基苯甲醛溶液，加15mL60%高氯酸溶液溶解。B.2.2.7
显色剂：量取15mL对二甲氨基苯甲醛溶液，溶于65mL异内醇中。B2.2.9
氢氧化钠溶液，c（NaOH)=6mol/L：称取24g氢氧化钠，加水稀释至100mL。B.3L-羟氢酸对照品溶液制备
B.3.1L-羟脯氨酸对照品储备液：取L-羟脯氨酸对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释成每1mL中含20μg的溶液。
B.3.2L-羟脯氨酸对照品系列溶液：精密量取L-羟脯氨酸对照品储备液2.5mL、3.75mL、5.0mL、7.5mL、10.0mL，分别置10mL容量瓶中，用水定容，配制L-羟脯氨酸对照品系列溶液。6
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