【YY医药标准】 医疗器械生殖和发育毒性试验 第4部分:两代生殖毒性试验

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1292.4—2017
医疗器械生殖和发育毒性试验
第4部分：两代生殖毒性试验
Test for reproductive and developmental toxicity of medical devices-Part 4:Two-generation reproductive toxicity test2017-02-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-01-01实施
YY/T1292《医疗器械生殖和发育毒性试验》分为四个部分：-第1部分：筛选试验；
第2部分：胚胎发育毒性试验；
—第3部分：一代生殖毒性试验；第4部分：两代生殖毒性试验。
本部分为YY/T1292的第4部分。
有关其他方面的医疗器械生殖和发育毒性试验将有其他部分的标准。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1292.4—2017
YY/T1292本部分是在参考了OECD416—2001《两代生殖毒性试验》并结合医疗器械/材料自身特点的基础上制定的。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家食品药品监督管理总局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口。本部分起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、深圳市医疗器械检测中心。本部分起草人：乔春霞、朱福余、曹苹、徐炜区。I
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GB/T16886.3中给出的检测潜在生殖和发育毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织（OECD）《化学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定而成，同时未给出详细的试验步骤，因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T1292的本部分参照OECD416试验方法的基本原则，并根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为GB/T16886.3中生殖和发育毒性试验中的一项方法标准医疗器械/材料的生殖和发育毒性潜能对人类健康有十分重要的影响。特别是针对可吸收性医疗器械或含可沥滤物的医疗器械。GB/T16886.3中推荐下列医疗器械/材料，在缺乏排除生殖和发育毒性风险证据的情况下，需考虑进行生殖和发育毒性试验。a）具有可能与生殖系统或胚胎（胎儿）直接长期或永久接触的器械，可吸收或可沥滤物质（如硅凝胶乳房植入物）；
b）储能医疗器械。
本部分提供关于试验样品对雌性和雄性动物生殖系统的整个生殖功能和行为作用的一般性资料，如性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠、分娩、哺乳、断奶以及子代的生长发育情况等，也可提供新生仔疾病、死亡、出生前后发育毒性等方面的初步资料，为下一步的毒性试验提供参考。除研究F1子代的生长发育外，本部分也可对F2子代的生长发育以及F2子代的雌性和雄性生殖系统进行系统评价。为进一步全面获得发育毒性和功能缺陷方面的资料，有时可能需要附加进行一些发育毒性和/或发育神经毒性试验或在其他试验中研究这些终点。由于受到试验样品制备以及试验方法确认等方面局限性的影响，在确定进行本部分试验之前，应充分考虑GB/T16886.1和GB/T16886.18的要求。应在评价医疗器械使用中引发两代生殖毒性风险的基础上，对进行试验的决定予以论证。对可吸收性或含可沥滤物质的医疗器械，如果在吸收，代谢和分布研究方面有充分可靠的数据，或者医疗器械浸提液中鉴别出的所有成分均无两代生殖毒性时，对医疗器械进行可接受的生物学风险评估后，如两代生殖毒性的风险已被排除，则无需再进行试验。Ⅱ
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1范围
医疗器械生殖和发育毒性试验
第4部分：两代生殖毒性试验
YY/T1292的本部分给出了医疗器械/材料两代生殖毒性试验方法。本部分适用于医疗器械/材料两代生殖和发育毒性评价。2规范性引用文件bzxZ.net
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1一2011,ISO109931.2009,IDT)
GB/T16886.2医疗器械生物学评价第2部分：动物福利要求（GB/T16886.2一2011，ISO10993-2:2006,IDT)
GB/T16886.3医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验（GB/T16886.3-2008,ISO10993-3:2003,IDT)
GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（GB/T16886.122005,ISO10993-12:2002,IDT)
3术语和定义
GB/T16886.1，GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的术语和定义适用于本文件4主要设备
实验室常用设备，生物显微镜，体视显微镜，游标卡尺，动物精子分析仪（可选）病理检查仪器。5试验原理
将不同组的试验动物给予特定剂量的试验样品。如器械预期应用于男性，为了得出该试验样品对精子形成的副作用，雄性宜在生长期给予试验样品并至少包括一个完整的精子形成周期（小鼠大药56d，大鼠大约70d）。为了得出该试验样品对发情周期的副作用，亲代雌性给予试验样品时间宜至少包括几个完整的发情周期，然后将动物合笼。合笼期间两种性别的动物都给予试验样品，在妊娠期和哺乳期只给予雌性动物。子代F1断乳后继续给予试验样品，并从子代F1的生长期、成熟期、交配后、子代F2出生至F2断乳。
6实验动物
6.1总则
所有的动物试验应在经国家认可机构批准并符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行！1
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并且还应符合GB/T16886.2的要求。6.2动物选择
6.2.1种属的选择
本部分推荐使用健康、性成熟大鼠。如果使用了其他种属，宜进行适当的论证。不宜使用低繁育率或众所周知的发育缺陷率高的种属。宜使用未经试验的健康动物并记录下试验动物的种属、品系、性别、体重和周龄。试验开始前，应尽可能降低试验动物间的体重差异使之不超过相同性别平均体重的20%。
6.2.2数量和性别
每一试验组和对照组宜包含足够数量的动物以得到大约20只左右的妊娠动物。对于高剂量组毒性过大或导致不育的物质，这种要求可能不适用。只有足够数量孕鼠才能对生育力、受孕、母鼠的行为、哺乳以及子代F1从胎儿至成熟期的生长发育、子代F2出生到断乳可能产生的潜在影响作出有价值的评价。
6.2.3饲养条件
试验动物的饲养环境温度宜为20℃～26℃，相对湿度为40%～70%。当采用人工照明时，宜按照12h照明和12h黑暗进行循环。动物可使用适宜的伺料饲养，不限制饮水。妊娠雌性宜单笼饲养并提供舒适的垫料。
6.2.4动物准备
试验前宜适应环境至少5d。试验之前应明确所用动物的亲属关系以避免发生同胞交配。宜将动物随机分为对照组和试验组（推荐按体重进行随机分组）。每个动物应有单独唯一的标记。亲代（P）动物应在开始试验前标记，子代F1则在动物断乳并选择用于交配前标记。所有被选的子代F1动物，要记录和保存其窝别来源的信息。当仔鼠需要称重或进行某项检查时，出生后应尽可能早地标记。7样品制备
7.1根据GB/T16886.12的原则，制备试验样品。只要可能，医疗器械都应在备用”状态下进行试验。7.2对于储能医疗器械，应以动物全身接触为宜，使用剂量应为与人体生殖器官接触所预期剂量的倍数。
8试验步骤
8.1总则
宜参考现有的毒理数据以及关于试验样品或相关物质的毒代动力学方面的所有信息来选择相应的剂量范围以免造成过度的母体毒性反应。这些信息也可有助于确定剂量的频次。8.2最大剂量的确定
以最大耐受剂量或动物模型的生理限量作为动物接触的最大剂量，该剂量应为估计的人体最大接触剂量（以克每千克或平方厘米每千克表示）的倍数。注：与典型的化学物生殖和发育毒性试验不同，多数材料可能得不出明显的剂量-效应关系，对于这些材料，可以考虑采用接触的最大剂量试验来判定是否存在毒性危害，但宜对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。2
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8.3剂量水平的选择
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若认为试验样品可能对试验动物产生两代生殖毒性时，宜使用至少三个试验组和一个对照组。除非受到理化特性和生物效应的限制，所选的最高剂量应引起毒性但不导致亲代动物死亡和承受严重痛苦。试验中，如果出现死亡，亲代(P)动物的死亡率应控制在10%以下。另两组应设计递减的剂量水平，能显示出任何与样品处理有关的作用和无可观察到不良反应水平（NOAEL）。递减组间距通常选择2倍一4倍，如果要设置第4个剂量组，该剂量组的组距则可以很大（如超过10倍）。如试验样品使用了介质，需设介质对照组。对照组除不给予试验样品外，应与试验组动物处理方式相同。8.4试验进程
亲代雄性、雌性应从5周龄～9周龄时开始每日给予试验样品。子代F1雌、雄鼠则从断乳后开始每日给予试验样品。对于亲代和子代F1的雌、雄鼠，样品给予应至少包括交配前10周和交配期2周。对不再需要评价生殖作用的雄鼠，应将其人道处死并进行解剖检查。亲代雌鼠应继续给予试验样品，从怀孕期直到子代F1断乳。宜根据每只动物的体重来确定各自的剂量，但对妊娠后三分之一时间的剂量调整宜谨慎。
亲代和子代F1雌，雄鼠应给予试验样品至试验结束。当不再需要亲代和子代F1雌，雄鼠时，应将其全部人道处死。人道处死断乳后没有用来交配的F1子代和所有F2子代子鼠。8.5动物交配
8.5.1亲代交配
每次交配时，雌鼠应始终与同剂量组但不是同窝的一只雄鼠合笼直至受孕或最长2周。每日早晨宜检查精子或阴栓，并将检查到精子或阴栓的当天规定为妊娠的第0天。如交配不成功，则考虑用同一组的已经证明交配成功的其他雄鼠与雌鼠进行重新交配。配对的动物应有明确的标识和记录，避免近亲交配。
8.5.2代F1交配
子代F1交配时，在断乳时从同一窝里至少挑出雌、雄鼠各1只并和同剂量但不同窝的其他动物进行交配以紧殖出子代F2。如客窝间的动物在体重和外表上没有显著性差异，则按随机原则从每窝重选出动物进行交配。如有显著性差异，则从每窝里选出最具代表性的动物。F1代只有性成熟后，才能开始进行交配。未受孕的动物宜明确未受孕的原因。包括可分别与已证实有生育能力的动物再进行一次交配、对生殖器官的组织病理学检查、发情周期和生精机能的检查。8.5.3二次交配
当首次交配时出现窝的大小与处理相关的改变或不确定的影响时，建议让亲代P或子代F1动物进行二次交配以紧殖出第二贫后代。方法是将没有素殖出后代的雌鼠或雄鼠与证实具有生育能力的异性鼠进行二次交配。如亲代P或子代F1都进行第二窝的繁殖，则要在最后一窝断乳后约一周再进行二次交配。
8.5.4窝的大小
应允许动物正常产仔和哺育子代至断乳期。窝大小的方法尚未标准化。如需标准化，宜详细描述所使用的方法。
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9结果观察
9.1临床观察
在整个试验过程中，宜每天至少一次观察每只试验动物。观察时间宜包括样品给予后预期反应高峰期。应详细记录动物的行为改变、难产或滞期分娩的表现和所有毒性体征。9.2体重和食物消耗量
亲代动物（P和F1）应在试验开始当天称重，此后至少每周一次。亲代雌鼠（P和F1)应在妊娠期第0天、第7天、第14天和第20天或第21天称重，哺乳期应在测量窝重的当天和处死动物当天进行称重。宜逐一报告每只成年动物的观察结果。在交配前期和妊娠期，至少应每周测量食物摄人量。9.3发情周期
对P和F1雌鼠发情期的长短与状态可在交配前和交配期任何时间进行阴道涂片观察，直到交配成功为止。如阴道涂片中发现有阴道/宫颈细胞，要鉴别出是黏膜紊乱还是假性妊娠造成的。9.4精子参数
9.4.1试验结束时，应记录所有P和F1雄鼠睾丸和附睾的重量，取一侧器官固定用于组织病理学检查。对于每组P和F1雄鼠中的不少于10只雄鼠，未固定的睾丸和附睾用于附睾尾精子的计数。收集附辜尾或输精管内的精子评价精子活力和精子形态。如观察到与处理相关的影响，或在其他的试验中发现了受试物对精子生成有影响，每个剂量组的所有雄鼠都应进行精子评价，否则精子计数只限于对照组和高剂量组的P和F1动物。
9.4.2应计数附辜尾精子的总数。可通过用于进行定性评价的悬浮液中的精子浓度和体积计数，或从匀浆的剩余附睾尾组织液中回收的精子数来计算附睾尾的精子存储量。所有剂量组中被选择的雄鼠在处死后立即进行计数，除非已经进行了影像记录或数字记录，或者标本已被冷冻用于以后的分析。应先对最高剂量组和对照组进行分析。如最高剂量组未见与处理相关的影响（例如对精子计数、精子活力和精子形态的研究），则不必分析其他剂量组。反之，若最高剂量组发现与处理相关的影响，则其他剂量组也应作进一步的分析评价。
9.4.3在处死动物后应立即评价附睾（或输精管）的精子活力或进行录像。精子的回收要尽量减少损伤，并用大家可接受的方法进行稀释作精子活动性分析。宜测定进行性活动精子的百分比。如果使用了计算机辅助运动分析，精子进行性活力的产生依赖于使用者所定义的平均通道速率和直线或线性指数的阈值。如果对样品进行了录像或在解剖时进行了拍照，随后只需对对照组和高剂量组P和F1动物进行分析。如果观察到了与处理有关的影响，其他低剂量组也应进行评价。如果没有进行录像或拍照，解时应对所有剂量组的样品进行分析。9.4.4应对附率（或输精管）的精子进行形态学分析。应用固定、湿式样品检查精子（每个样品至少200个），按正常或不正常分类。不正常的精子形态包括精子融合，游离头，畸形头和（或）畸形尾。在处死每个剂量中所选雄鼠后应立即进行精子形态分析，或进行录像或拍照，备于以后分析。涂片固定后，也可在以后进行阅片。在这些情况下，应先对最高剂量组和对照组进行分析。如最高剂量组没有发现与处理有关的影响（例如对精子形态的影响），则不必分析其他剂量组。反之，若最高剂量组发现与处理有关的影响，则其他剂量组也应作分析评价。9.4.5若在90d或以上的全身毒性试验中已经对精子进行了上述所有参数的检查，在本标准中不必重复测定。但建议保存亲代精子的样本或数字化记录必要时可进行评价。4
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9.5子代
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9.5.1在分娩后（泌乳当天）应尽可能及时进行检查，包括幼仔的数量，性别，死产、活产以及异常等。如在分娩当天发现死仔，检查有无缺陷、导致其死亡的原因并加以保存。活仔鼠于出生当天（泌乳当天）或生后第1天汇总活仔的数量并逐个称重，并在泌乳的第4天、第7天、第14天和第21天进行称重。同时，还要记录所观察到的母体和子代的身体或行为异常。9.5.2子代的身体发育主要通过体重增加来记录。其他的体格参数（如开耳开眼、出牙，毛发生长）可以提供补充信息，但这些信息最好与性成熟资料（如阴道开口或包皮分离时的日龄和体重）一起评价。如果未单独设计相关功能（如运动活力，感觉功能，反射功能的发育）试验，特别是与性成熟有关的功能检查，就要在F1子代断乳前和/或断乳后进行这些功能的检查。应检查断乳后被选作交配的子代F1动物阴道开口和包皮分离的日龄。如果子代F1的性别比或性成熟时间出现改变，应在子代F2出生当天测量肛门与生殖器间的距离。如动物出现了明显有害作用（如体重增加明显缓慢等），这些组就可以不进行功能检查。如进行功能检查，不应选择将进行交配的鼠。9.6大体解部
试验结束时和试验期间死亡的所有亲代（P和F1)动物、所有外观畸形或出现临床症状的仔鼠，以及从F1和F2子代两代中随机抽取的至少每窝雌，雄各一只仔鼠/一个性别/一窝，都应肉眼观察有无结构异常和病理学改变，特别是生殖器官的形态异常或病理改变。死亡或因濒死被人道处死的仔鼠在被浸泡固定前也应检查有无缺陷和/或死亡原因并保存标本。检查所有初产母鼠的子宫，观察着床位置及数量。
9.7器官称重
试验结束时，应对所有的P和F1动物进行称重并测量以下器官的重量（成对的器官应分别称重）：子宫、卵巢；睾丸、附睾（附辜整体和附睾尾）：前列腺：精囊（内含凝固腺）及其液体（作为一个单位）：脑、肝，肾，牌，垂体，甲状腺，肾上腺和已知的靶器官。试验结束时对F1和F2中被选作大体解检查的仔鼠进行称重并对随机抽取的每窝每性别一只动物进行脑、脾和胸腺的称重。如可行，宜结合其他毒性试验的观察结果来评价大体解韵和器官重量的意义。9.8组织病理学检查
9.8.1亲代动物
应将亲代P和F1动物的以下器官和组织或其代表性样本固定并保存，以便于进行组织病理学检查：
一阴道，带着子宫颈的子宫和卵巢（用合适的固定剂保存）；一侧睾丸[用布英防腐液（Bouinis）或类似的固定剂保存」，一侧附睾，精囊、前列腺和凝固腺；从被选作交配的所有P和F1动物中已经确认的靶器官。应对高剂量组和对照组被选作交配的所有P和F1动物进行以上所列器官和组织的全面组织病理学检查。亲代P动物的卵巢检查则作为备选。必要时，检查低剂量组和中剂量组的器官改变。另外，还应对低剂量组和中剂量组动物的生殖器官怀疑存在生殖能力减退（如不能进行交配、受孕、不能生产或分娩正常子代，或动情周期、精子数量、活力或形态受到了影响）的动物进行病理学检查。应检查所有肉眼可见的损害如萎缩或肿瘤。应对罩丸进行详细的组织病理学检查L例如用布英防腐液（Bouinis）固定，进行石蜡包理并切取4μm～5μm厚的切片］以鉴别出与处理有关的影响，如滞留的精细胞、缺失生殖细胞层或类型不明以及多核巨细胞或生精细胞成堆进人生精管腔内。完整的附睾检查应包括头，体和尾，可通过附罩的纵切面检查。应根据白细胞浸润、细胞类型的改变程度、异常细胞类型以及精子被吞噬状态来评价附辜。可5
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用对氨基水杨酸（PAS）和苏木精对雄性动物生殖器官进行染色和检查。泌乳后的卵巢组织病理学检查应包括初始和生长卵泡以及泌乳期的黄体。组织病理学检查应对原始卵泡数进行定性。应对F1代雌鼠进行原始卵泡的定量分析；动物数、卵巢切片的选择以及切片样本大小均应符合所有评价程序统计学要求。该项检查应包括原始卵泡的计数（这种原始卵泡常和小的生长卵泡混合在一起），并将试验样品组和对照组的结果进行比较。9.8.2断乳动物
应将所有具有外部缺陷或临床症状的仔鼠，以及从未被选作交配的F1和F2代中随机挑出的每窝每性别一只仔鼠中，大体检查所见的异常组织和靶器官，进行固定并保存以用于组织病理学检查。在对保存的组织进行全面组织病理学检查时要重点检查生殖系统的器官。10试验数据和报告
10.1数据
数据要逐一列表报告，以显示试验开始时每组和每代的动物数，试验期间死亡或人道处死的动物数和死亡或处死时间，具有生育能力的动物数、妊娠动物数、出现中毒症状的动物数。毒性症状的描述，其中应包括症状出现和持续的时间，毒性反应的严重程度，组织病理学的改变类型及所有相关数据。应采用适宜的统计学方法对试验结果进行统计。试验设计应包括统计学方法的选择。10.2结果评价
两代生殖毒性试验结果应根据观察到的反应，其中包括户检大体解和组织病理学检查结果作出评价。评价包括有无剂量反应关系：接触剂量与异常（包括肉眼观察到的损害）有无、发生率和严重程度、靶器官、生育率的影响、临床异常、对生殖功能和窝的影响、体重改变、死亡率和其他任何毒性反应之间的关系。如有可用的数据评价时还应结合受试物的理化特性以及毒代动力学数据，如适用。一个合格的生殖毒性试验应对无明显毒性作用水平作出满意的评估，明确对生殖、产仔、哺乳及幼鼠生长方面（包括体格生长和性发育）的有害反应。10.3试验报告
10.3.1，受试物
试验报告应包括以下受试物信息：a）物理性状以及相关的理化特性b）样品描述。
10.3.2浸提介质，如适用
如选用浸提介质，宜对所选择进行说明。10.3.3试验动物
试验报告应包括以下试验动物信息：a）动物品系；
b）动物数量、周龄和性别；
c）动物来源、饲养条件、饲料、垫料：d）试验开始时每只动物的体重。6
10.3.4试验条件
试验报告应包括以下试验条件信息：a）剂量选择的适宜性：
b）样品制备的详细信息；
c）样品给予途径的详细信息。
10.3.5结果
结果应包括以下信息：
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a）如可能，计算食物和饮水的消耗量，食物利用率，P和F1动物对受试物的消耗量（不包括交配期和泌乳的最后3d)；
吸收数据，如可获得；
被选作交配的P和F1动物的体重；c)
窝和胎鼠、仔鼠的体重；
被处死的亲代动物的体重以及绝对和相对器官重；临床症状、严重程度和持续时间（是否可逆)；试验过程中的死亡时间或动物是否存活到试验结束g）
按性别和剂量组分别记录的毒性反应，包括交配成功率，生育力、受孕率，活产率，出生率，生育率和秘乳率；报告中应有用于计算这些指数的动物数；i）
对生殖、子代以及出生后生长等方面的毒性作用或其他作用；大体解所见；
所有组织病理学检查所见的详细描述；周期正常的P和F1的雌性动物数以及周期长度：m）
附辜尾的精子总数，进行性活动精子的百分比，形态学上正常的精子百分比以及每种异常精子的百分比；
交配，交配成功的时间，包括交配前的天数；n)
o）妊娠期的长度；
着床数，黄体数和胎仔数；
活产数和着床后又丢失的数量；如果统计了发育不全的幼仔数，就应报告其中具有大体可见异常的幼仔数；s)
幼仔体格方面的数据和出生后的其他发育数据，应对评价的体格指标进行说明：如果可能，则要提供幼仔和成年动物的功能检查数据；合适的结果统计学处理。
11结果的解释
本试验可反映动物在整个生殖周期里多次接触某一试验样品后对生殖功能所产生的影响。特别是试验能提供关于生殖功能参数、子代生长发育和存活的资料。宜将该研究的结果结合亚慢性、致畸性，毒代动力学试验和其他研究结果一起来解释。试验结果可用于评价是否需要进行进一步研究，但试验结果外推到人仍存在着一定的局限性。但试验结果可提供无明显毒性作用剂量水平和制定人体安全接触水平依据。
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医疗器械生殖和发育毒性试验
第4部分：两代生殖毒性试验
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开本880X12301/16
印张0.75字数18千字
2017年10月第一版2017年10月第一次印刷书号：155066·2-31950定价18.00元如有印装差错
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