【YY医药标准】 组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留a-Cal抗原检测

ICS11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1561—2017
组织工程医疗器械产品
动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测Tissue engineering medical device products-Remnant α-Gal antigen determination in scaffold materials utilizinganimal tissues and their derivatives2017-03-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草YY/T1561—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会（SAC/TC110/SC3)归口。
本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、中国人民解放军第四军医大学、冠吴生物科技股份有限公司。
本标准主要起草人：徐丽明、邵安良、陆艳、赵红妮、金岩、张勇杰、汤银喜、张伟、柴媛。YY/T1561-2017
动物源性生物材料及含动物源性生物材料的医疗器械或异种器官中残留的抗原是该类生物材料及器官移植中超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性的主要因素。尽管动物源性生物材料在制备过程中经过了脱细胞和去除抗原的处理，但残留的异种抗原仍存在着导致慢性免疫毒性反应的风险。已有研究显示α-半乳糖基抗原（αl，3galactosyle，Alphal，3Gal或α-Gal）是引起动物源性生物材料或异种器官移植时超急性免疫排反应的主要靶抗原。α-Gal的结构为Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R，该抗原是半乳糖基与细胞膜上的蛋白或脂结合构成的一组完全性抗原。α-Gal主要受α-1，3半乳糖基转移酶（αl，3-galactosyltransferase，a-GT）及异红细胞糖苷酯合成酶（isoglobotriosylceramidesynthase或isogloboside3synthase，iGb3S）调控。由于人体及类人猿，古世纪猴的半乳糖昔转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达α-Gal抗原，但人肠道菌群持续表达α-Gal抗原，这种刺激致使人体免疫系统持续产生抗α-Gal抗体，达到循环免疫球蛋白的1%～3%。因此，当人体接受含有α-Gal抗原的生物材料或异种器官移植时会引起超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应。动物源性生物材料或异种器官移植中α-Gal抗原的去除成为降低免疫排斥反应和慢性免疫毒性反应的关键之一。目前，尚无动物源性生物材料中残留α-Gal抗原的定量检测方法。本标准通过使用α-Gal抗原特异性单克隆抗体M86，以人工合成的Gal-BSA抗原与Gal抗原阴性基质混合作为参照品建立标准曲线，通过竞争性ELISA抑制方法定量检测动物源性生物材料中残留的α-Gal抗原。同时，试验体系中加人了Gal抗原阳性和阴性参考品，使试验的灵敏性和特异性得以监控。竞争性ELISA抑制方法是一种常用的方法，其原理是：首先将标准曲线样品及试验样品的α-Gal抗原与M86抗体反应（消耗部分M86抗体）：然后用Gal-BSA作为固相抗原，通过ELISA方法检测第一次反应后上清液中的剩余M86抗体：进而可利用标准曲线计算待测物中的α-Gal抗原含量。由于第次待测物中的α-Gal抗原与M86抗体的反应对后续的剩余M86抗体与固相Gal-BSA抗原的反应构成了抑制效应，故称为ELISA抑制法。Ⅱ
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1范围
组织工程医疗器械产品
动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测YY/T1561—2017
本标准给出了组织工程医疗器械产品支架材料制备时使用的动物源性生物材料中残留α-Gal抗原的定量检测方法。
本标准适用于制备组织工程医疗器械产品支架材料的各种动物来源的生物材料或其衍生物的α-Gal抗原检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T16886.20医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则与方法(GB/T16886.20—2015，ISO/TS10993-20:2006,IDT)YY/T0606.25组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
3术语和定义
GB/T16886.20和YY/T0606.25界定的术语和定义适用于本文件。4试剂和仪器
4.1试剂
试剂包括：
磷酸盐缓冲液（PBS，phosphatebufferedsaline.pH7.4)；a
碳酸盐缓冲液（pH9.5）：
市售α-GalEpitope(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R），mAb（M86），分装后-20℃保存；市售Galα1-3gal-BSA（3atomspacer，简称Gal-BSA），溶于去离子水中，分装后一20℃保存d)
备用；
辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗（IgM-HRP）；e)
TMB(33，5，5'-Tetramethylbenzidine)显色液；g）
血清百蛋白；
裂解液（市售品），其主要组成成分包括：50mmol/L三甲基氨基甲烷（Tris，pH7.4）150mmol/L氯化钠（NaCI)，1%（体积分数）聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），1%（质量浓度）脱氧胆酸盐（sodiumdeoxycholate），o.1%（质量浓度）十二烷基硫酸钠（SDS），原钒酸钠（sodiumorthovanadate），氟化钠（sodiumfluoride），乙二胺四乙酸（EDTA），亮抑酶肽1
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（leupeptin）及苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）；洗液：0.05%（体积分数）的吐温-20/PBS；i）
10%（体积分数）H.SO4
k）Gal抗原阳性生物材料参考品；1）
Gal抗原阴性生物材料参考品。
4.2仪器
仪器包括：
a）37℃恒温摇床；
酶标仪：
冷冻离心机；
震荡器：
高精度天平（0.0001g）；
勾浆仪：
移液枪；
h）pH计。
5试验步骤
5.1样品准备
5.1.1试验样品
精确称取试验样品（2mg~10mg），置于2.0mL或5mL无菌离心管内；若为固态块状或片状试验样品，则用无菌眼科剪将样品剪裁成细小碎块，液态或粉未状试验样品无需特殊处理：加入裂解液（可使用市售品）配制成样品浓度为2mg/mL~10mg/mL使用前加人1%（体积分数）1mmol/LPMSF为操作方便推荐至少每份样品配制2mL的裂解液」，低温匀浆2min10min，至样品全部粉碎，形成均匀组织匀浆；室温（25℃土5℃）放置30min～3h至样品全部裂解（肉眼观察无明显固态物质存在）离心（3000r/min~5000r/min）取上清备用。注1：每份样品设平行样3份，最终测定结果取其平均值士SD。注2：可以根据委托方的要求，取不同批号或同一批号的样品3份，用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性。5.1.2标准曲线样品
精确称取Gal抗原阴性生物材料参考品（冻干粉）样品2mg，置于2mL或5mL无菌离心管内，加人裂解液［使用前加人1%（体积分数）1mmol/LPMSF］配制成样品浓度为2mg/mL，含Galα1-3gal-BSA；室温（25℃士5℃）放置30min~3h至样品全部裂解，进行离心（3000r/min~5000r/min）后取上清液，用裂解液进行倍比梯度浓度稀释，得到最少不低于5个Galα1-3gal-BSA系列稀释浓度的稀释液，用于做标准曲线。为得到每次试验的最低检测限，应稀释到检测OD值与Gal抗原阴性参考品检测OD值相等或相近的浓度，从而确定其上一个浓度为本次试验的最低检测限注：宜根据待测样品Gal抗原含量的高低，通过预实验确定Galα1-3gal-BSA的浓度范围，保证待测样品的检测OD值在标准曲线范围内。
5.1.3Gal抗原阳性和Gal抗原阴性参考品样品分别精确称取2mgGal抗原阳性和阴性参考品（冻干粉），放于2mL或5mL无菌离心管内，加人2
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裂解液配制成2mg/mL［使用前加入1%（体积分数）1mmol/LPMSF]，室温（25℃土5℃）放置30min～3h至样品全部裂解；将裂解后样品进行离心后取上清液备用。5.1.4对照孔样品
设定M86/Gal抗原阴性生物材料参考品裂解液反应样品1份作为100%的反应值；裂解液反应样品1份作为背景值。
5.2M86抗体孵育
5.1中每个样品分别取200μL置于1mL离心管中，标记，每管分别加入等体积（200μL）稀释比例为1：100～1：200的M86抗体溶液（应保证M86抗体是过量的，可通过预实验确认）。混匀后在室温（25℃十5℃）温和摇动（如：100r/min）条件下反应2h，之后置于4℃孵育过夜。次日，在离心速度为14000g.4℃条件下离心30min后取上清液备用注：因M86是一种非纯化的抗体，不同批次之间的活性可能存在差异。建议在新试剂使用前先确认抗体活性与既往使用批次是否有差异，必要时重新验证抗体稀释比例的合理性。nge
5.3ELISA抑制法检测上清液中剩余M86抗体5.3.1固相抗原包被板的制备
首先用去离子水将Galα1-3gal-BSA（如：500μg/mLSA）稀释一定倍数（如：25倍），再用pH9.5的碳酸盐缓冲液再次稀释（如：10倍），制备2μg/mL1-3gal-BSA稀释溶液。取100pL/孔，加入酶标板，混匀后在室温温和摇动2h，之后置于4孵青过夜进行包被。次日用洗液（0.05%的吐温-20/PBS）洗板至少3次（伴随温和摇动，100r/min），在吸水纸上拍干。加人1%（质量浓度）的血清白蛋白200uL/孔进行封闭，置于37℃，2准随温和摇动。之后再次洗板拍干备用。注1：一次制备的Galα1-3gal-BSA包被板可封保存，一周内使用。注2：配制碳酸盐缓冲液：称取碳酸钠056g炭酸氢钠0.8401g，用约80mL超纯水溶解，在pH仪下调整至pH为9.5，定容至100mL。
5.3.2剩余M86抗体检测
分别取100uL5.2中准备的试验样品与M86抗体反应后的反应物上清液（含有M86剩余抗体）加人固相抗原包被的96孔板中（每份样品3个复孔），用封口膜密封96孔板，置于37℃振荡孵育2h后，用洗液洗板3次（伴随温和摇动）。加入IgM-HRP，37C振荡孵育1h后，用洗液洗板3次（伴随温和摇动）。加100μLTMB显色液避光显色15min，用10%H,SO.50μL终止液显色后，在酶标仪上于450nm波长处测吸光度值。
6抗原含量的计算
6.1根据测定的吸光度值，计算各样品的M86结合抑制率。IR=[(M-b)-(T-6)]/(M-b)X100%
式中：
M86结合抑制率；
对照孔反应OD值均值（100%反应）；试验样品反应OD值均值（剩余M86抗体的反应）：裂解液反应OD值均值。
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标准曲线的绘制：
以Galα1-3gal-BSA的浓度（μg/mL)为横坐标，其M86的结合抑制率（%）为纵坐标绘制最佳曲线方程，如：指数曲线，获得指数曲线方程Y一AXexp(一X/t）十y.，或者对数曲线，获得对数曲线方程Y=aXn(X)+b，其中，Y代表M86的结合抑制率；X代表样品浓度。注：可使用Origin软件或其他软件，如四参数方程软件直接计算。6.3样品中所含抗原表位数计算：a）将试验样品的M86结合抑制率代入6.2中标准曲线的指数曲线方程，计算出试验样品对应的标准曲线样品Gal-BSA的质量浓度（X.ug/mL）。b）计算试验样品的单位质量Gal抗原表位数。N,=(X XVXNs)/M
式中：
·（2）
试验样品单位质量Gal抗原表位数，单位为个每毫克或个每微克（个/mg或个/μg）；标准曲线样品Gal-BSA质量浓度，即，6.2中标准曲线指数曲线方程中的X，单位为微克每毫升（ug/mL)；
试验样品的反应体积，单位为毫升（mL）：单位Gal-BSA的Gal抗原表位数，1.82X101*个/μg；试验样品质量（等于试验样品在反应体系中的质量浓度乘以反应体积），单位为微克或毫克（μg或mg）
体积是指加人96孔板时的体积。注1：此处的质量浓度指的是反应体系中样品与M86反应时的终滤注2：根据Gal-BSA(Galα1-3gal-BSA)质量~BSA含量（已经过量白质测定验证），BSA分子质量：M=66.33kD，a-BSA中BSA分子数：9.08×101个/g；根据每BSA单位质量分子数：n=9.08×1018个/g，因此，单位质量个Gal-BSA中BSA分子含有的Gal抗原残基数约20个，因此，单位质量Gal-BSA中Gal抗原残基数=1.82×1014个/μg。
如果试验样品中α-Gal抗原微量或者痕量而难以定量时，应给出本次检测试验的最低检测限，表示出低于最低检测限的水平。可同时对比检测脱细包或去除抗原工艺前的样品，作为考察工艺有效性的参考。
6.4最低检测限的确定：
通过找到标准曲线最低稀释样品的检测OD值与Gal抗原阴性参考品检测OD值相等或相近的浓度，这个浓度就是未能测定的依7试验可接受准则
，从而确定其上一个浓度为本次试验的最低检测限。7.1Gal抗原阳性参考品的Gal抗原测定值与标准品定值的相对偏差（relativedeviation，RD）应小于20%。
阴性参考品的α-Gal抗原测定为阴性。7.2
7.3标准曲线的R2应大于或等于0.95。样品检测结果的变异系数(CV)应小于或等于30%。7.4
8试验报告
试验报告应包括：
a）试验是否符合可接受准则及具体指标值：b）试验结果（平均值土SD）：单位质量的α-Gal抗原数（个/mg或个/ug），应标明干重或湿重。c）本次试验的最低检测限。
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参考文献
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2017年11月第一版
书号：155066：2-32535
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