【YY医药标准】 医疗器械遗传毒性试验 第3部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的TK基因突变试验

ICS11.040.01
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0870.3—2019
代替YY/T0870.3—2013
医疗器械遗传毒性试验
第3部分：用小鼠
淋巴瘤细胞进行的TK基因突变试验Testforgenotoxicity of medical devices-Part 3:TK gene mutation test using mouse lymphoma cells2019-07-24发布
国家药品监督管理局
2020-08-01实施
YY/T0870《医疗器械遗传毒性试验》，由下列部分组成：第1部分：细菌回复突变试验：
第2部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验一第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的TK基因突变试验：第4部分：哺乳动物骨髓红细胞微核试验；一第5部分：哺乳动物骨髓染色体畸变试验。本部分为YY/T0870的第3部分。
本部分按GB/T1.1—2009给出的规则起草。YY/T0870.3—2019
本部分代替YY/T0870.3—2013医疗器械遗传毒性试验第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验》，与YY/T0870.32013相比，除编辑性修改外主要技术变化如下：标准名称修改为《医疗器械遗传毒性试验第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的TK基因突变试验》；
增加了术语：克降效率（见3.1）：染色体断裂剂（见3.2）：移码突变剂（见3.4）：有丝分裂重组（见3.5）：突变（见3.6）：表型表达时间（见3.8）：悬浮生长（见3.10）：相对悬浮生长率（见3.11）：相对总生长（见3.12）；S9肝匀浆（见3.13）；S9混合物（见3.14）；未处理对照（见3.15）；增加了对S9的注释（见第5章）：修改了对细胞系的相关要求（见6.1)；修改了细胞自发突变清除的相关步骤（见6.2)；修改了支原体污染检测的相关要求（见6.3）；修改了核型稳定性检测的相关要求（见6.4）；增加了阳性对照的选择原则（见9.2)；增加了“未处理对照”（见9.3)；增加了预实验的概述（见10.1.1)；修改了“接触处理”的相关步骤（见10.1.2)；修改了“0天的平板接种效率（PE。平板）”.将平板培养时间改为10d~12d（见10.1.3)；修改了平板培养时间，改为10d～12d(见10.2.3.3)；增加了“相对悬浮生长率”（RSG)（见11.3)；增加了“相关总生长（RTG）”（见11.4）；删除了“式（4)小集落突变率”（见11.4)；增加了“实验室能力”（见12)；增加了“历史对照数据\（见13)：增加了“阴性判断标准”（见14.1)；增加了“阳性判断标准”（见14.2）；增加了“结果评价”（见15）；增加了背景知识（见附录A）。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家药品监督管理局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会（SAC/TC248）归口YY/T0870.3—2019
本部分起草单位：山东省医疗器械产品质量检验中心、中国食品药品检定研究院。本部分主要起草人：孙令骁、王国伟、韩倩倩、史建峰。本部分所替代标准的历次版本发布情况为：YY/T0870.32013。
YY/T0870.3—2019
GB/T16886.3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织（OECD)发布《化学品测试指南》中规定的方法，但这些方法是针对化学品的特性制定面成，同时未给出详细的试验步骤，因此不适宜直接用于医疗器械/材料的检测。YY/T0870的本部分参照OECD试验方法基本原则·并根据医疗器械/材料的特性对试验方法进行了适当的修改，规定了详细的试验步骤，可作为GB/T16886.3中遗传毒性试验的补充方法标准YY/T0870的本部分参照OECD490(2016）《用TK基因进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验》并结合医疗器械/材料自身特点制定，即在有和无代谢活化系统的情况下，通过医疗器械/材料诱导小鼠淋巴瘤细胞（L5178YTK+3.7.2C)基因正向突变情况，来评价试验样品潜在的致突变性。本部分中根据在培养液中的生长能力和自发突变率是否稳定选择细胞。体外进行的试验通常都需要用外源性代谢活化系统。但外源性代谢活化系统并不能完全模拟哺乳动物体内的代谢条件。pH和渗透压的改变或受试样品的细胞毒性较高等可导致假阳性结果，从而使试验结果无法反应体内基因突变的真实情况。OECD中关于TK基因突变试验的背景知识参见附录A。1范围
YY/T0870.32019
医疗器械遗传毒性试验第3部分：用小鼠淋巴瘤细胞进行的TK基因突变试验YY/T0870的本部分规定了使用小鼠淋巴瘤细胞系（L5178YTK+/-3.7.2C)进行医疗器械/材料体外哺乳动物细胞基因突变试验的方法。本部分适用于采用微孔板法，使用小鼠淋巴瘤细胞系（L5178YTK+/-3.7.2C)进行TK基因突变试验，采用相对存活率（RS）和相对总生长（RTG）两种指标来评估细胞毒性的方法。注1：口腔材料的体外哺乳动物细胞基因突变试验见YY/T0127.17注2：纳米材料的体外哺乳动物细胞基因突变试验可能需要对本部分中的方法进行特定的修订.但本部分未给予措述。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T16886.1
医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.3医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验GB/T16886.12
2医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照材料3
术语和定义
GB/T16886.1、GB/T16886.3和GB/T16886.12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
克隆效率cloningefficiency
低密度下接种的细胞长成可计数的集落的百分比。3.2
染色体断裂剂
clastogen
任何能引起细胞或生物体的染色体结构畸变的物质。3.3
正向突变
forwardmutation
从原型(野生型)转变至突变型的基因突变，可引起酶活性和编码蛋白的改变和丢失3.4
Jframeshiftmutagens
移码突变剂
能引起DNA分子中单个或多个碱基对的增加或减少的物质3.5
有丝分裂重组
mitoticrecombination
在有丝分裂过程中，同源染色单体之间的重组可能诱导DNA双链断裂或杂合性缺失。1
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mutagenic
在基因或染色体结构（染色体畸变）中产生DNA碱基序列的遗传变化3.7
mutantfrequency(MF)
突变频率
观察到的突变体细胞与活细胞的数目之比值。3.8
phenotypicexpressiontime
表型表达时间
从处理期结束以后，细胞内基因组水平遗传物质改变，而先前存在的基因产物都被耗尽最终导致表型改变的时间过程
相对存活率
relativesurvival(RS
处理结束后，接种的处理细胞形成集落的能力（平板效率），通常以试验组与阴性对照组的平板效率比值表示。
suspensiongrowth(SG)
悬浮生长
在试验过程中的处理期和表型表达期内细胞的增殖倍数。对于短期接触（4h）悬浮生长是第一天的增殖倍数乘以第二天的增殖倍数。如果进行长期接触（24h)，悬浮生长是处理期内细胞的增殖倍数乘以表达期第一天和第二天细胞的增殖倍数。3.11
相对悬浮生长率
relativesuspension growth(RSG)试验组与阴性对照组/未处理对照组总的两天的悬浮生长的比值，包括处理期内试验组与阴性对照组/未处理对照组相对生长率的比值。3.12
相对总生长
relativetotalgrowth(RTG)
衡量试验组细胞毒性的指标，是试验组在试验的处理期、两天的表达期和突变体筛选克隆期内（相对于阴性对照组)相对生长率的衡量指标，3.13
S9liverfractions
S9 肝匀浆
9000r/min离心后的肝匀浆上层液体，即新鲜肝脏提取物。3.14
S9混合物
S9肝勾浆和代谢酶活性所必需的辅助因子的混合物。3.15
未处理对照
untreated controls
未经处理（既无试验样品也无浸提介质）但与接触试验样品的培养物进行相同过程的培养物。4主要设备
超净工作台、CO：培养箱、恒温水浴箱、恒温振荡器、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器等、注：本部分推荐的试验方法为微孔板法2
5活化系统、培养液和试剂
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常用的试验用活化系统为S9混合液，S9和S9混合液的制备参见附录B的规定或购买市售商品。培养液和试剂参见附录C的规定制备或购买市售商品：注：在细胞的处理过程中，宜避免使用会降低分裂指数的试剂，尤其是一些钙络合剂。6细胞系
6.1细胞系
使用小鼠淋巴瘤细胞系（15178YTK+/-一3.7.2C)。鉴于细胞性状稳定性要求，试验细胞系最好新取自冻存细胞。细胞在35℃～38℃培养，增殖周期为10h左右。实验室宜测定细胞周期时间，并与公开发表的细胞特征相一致。经过传代培养后，细胞呈对数生长状态，细胞持续培养最多不超过3个月。
6.2细胞自发突变清除
6.2.1宜适时检查冻存细胞的自发突变频率。一般试验细胞系的平均自发突变频率为50×10-6~170×10-。当细胞突变频率偏高时，按6.2.2~6.2.4对自发突变细胞进行清除。6.2.2将对数生长的细胞配制成2×10个/mL，加人100倍的THMG液，加入量为总体积的1%。置COz培养箱（含cO，体积分数5%）培养24h；6.2.3培养24h后以200g离心5min，除去上清液，加人新鲜RPMI1640培养液，细胞浓度调整为2×10°个/mL。加人100倍的THG液加人量为总体积的1%。培养45h48h，注意避免过度培养：6.2.4将培养后的细胞以200g离心5min，除去上清液后加入培养液直接使用或加入冻存液，细胞浓度调整为2×105个/mL～5X10°个/mL。分装于冻存管中冻存。6.3支原体污染检测
宜对新购买细胞或冻存细胞之前进行支原体的检测，以保证细胞无支原体的污染。6.4
核型稳定性检测bzxz.net
宜通过检测平均染色体数目来判断核型稳定性，通常对新购买细胞或冻存细胞之前进行，以保证细胞没有发生核型的变化。
7试验前准备
器具灭菌
与试验和对照样品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min，或置电热干燥箱内160℃2h。
试验环境要求
试验应在无菌操作台或超净工作台中进行。8样品制备
宜根据GB/T16886.12的原则制备试验液。宜采用两种溶剂浸提，推荐0.9%氯化钠注射液（或无3
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血清细胞培养液）和其他适宜溶剂作为浸提介质。浸提介质不应影响试验的进行，例如改变细胞生长，影响试验样品的完整性，与培养容器反应，破坏代谢活化系统等。如怀疑试验样品可能对本试验细胞系产生毒性作用时，应进行预试验来确定适宜的试验液浓度。注1:ISO109932014附录A中针对不同的医疗器械提供了A、B、C3种样品制备方法，可参考使用注2：若采用浸提液进行试验，当最高浓度的浸提液试验结果为阴性时，可考患单剂量组试验，但宜对试验所采用的剂量选择提供相应的支持性数据。注3：如选用0.9%氟化钠注射液作为浸提介质，最终接触时浓度宜不大于10%（体积分数）：高浓度的有机溶剂具有细胞毒性作用，因此，如采用有机溶剂为浸提介质，最终接触时浓度一般宜不大于1.0%（体积分数）：如选用含血清细胞培养液作为浸提介质，最终接触时浓度宜为100%（体积分数），若使用没有充分确认的溶剂（如乙醇或丙酮），则应提供相应的数据支持资料来表明它们与试验样品和测试系统之间的相容性并排除溶剂自身的遗传毒性，在缺乏支持数据的情况下，推荐使用未处理对照，以证明所选择溶剂的适宜性。注4：可降解/吸收产品的样品制备宜考虑产品的溶解度、PH和渗透压对试验体系的影响。9
对照品制备
阴性对照
阴性对照选用同批号试验样品浸提介质，不加试验样品并在同条件下制备阳性对照
阳性对照用以证明实验室在所用测试方案的条件下鉴定诱变剂的能力和测试外源性代谢活化系统的有效性（如适用）.以及能充分检测大/小集落的TK突变体。阳性对照物举例见表1，如有充分理由时也可采用其他适宜的阳性对照物。如果同时进行与使用相同接触时间的非活化测试，则该单一阳性对照反应将同时证明代谢活化系统的活性和测试系统的反应性。长期接触（无代谢活化系统）时宜单独设置阳性对照。每个阳性对照宜设置一个或多个浓度，以期提高其可重复性和可检测性，从而证明测试系统的灵敏度，并且阳性对照的反应不宜受到超过本部分规定限值的细胞毒性的影响。阳性对照细胞毒性的上限应该与试验组相同，即相对存活率（或相对总生长）不能低于10%。可使用一个浓度（或者系列浓度中的一个浓度）的试验结果来证明已经满足阳性对照的可接受标准。而且，阳性对照的MF值必须在实验室已经建立的可接受范围内。阳性对照物质举例
代谢活化条件
无外源性代
谢活化系统
有外源性代谢
活化系统
阳性对照物
甲磺酸甲酯（methylmethanesulphonate.MMS）丝裂霉索C(mitomycinC)
4-硝基喹味-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide)苯并（a)［benzo（a)pyrene]
环磷酰胺（cyclophosphamide）环磷酰胺一水化合物
(eyclophosphamidemonohydrete)7.12-二甲基苯
[7,12-dimethylhenz(a)anthracene.DMBA]3-甲基胆意（3-methylcholanthrene）CASRN
66-27-3
50-07-7
56-57-5
50-32-8
50-18-0
6055-19-2
57-97-6
56-49-5
9.3未处理对照
如不能证实所用浸提介质不具有致突变性，还需设置未处理对照。10试验步骤
10.1预试验（如怀疑试验样品可能对本试验细胞系产生毒性作用时）10.1.1概述
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宜避免最高浓度的试验样品或浸提液产生的假阳性反应，如产生过度的细胞毒性、在细胞培养液中出现沉淀或pH和渗透压发生显著变化。如果测试物使培养液的pH随时间发生明显的变化，则可以调节最终处理培养液的PH，以避免产生假阳性结果并保持适宜的培养条件当怀疑试验样品具有细胞毒性时，应以试验样品或浸提原液作为最高浓度组进行梯度稀释，最高的试验浓度为相对存活率（或相对总生长）在10%～20%的浓度，梯度稀释宜包括从中到小或无细胞毒性的浓度范围。在一些情况下，如试验样品具有陡峭的浓度反应曲线，则可适当缩小间距或将检测的浓度增加。
10.1.2接触处理
以0.9%氧化钠注射液作为浸提介质为例，取生长良好的细胞.建议调整细胞浓度为1×10°个ml（以保证细胞终浓度为5×105个/mL）。无活化系统组取10mL细胞悬液与2mL试验或对照样品以及1mLPBS混合，加人含血清培养基至终体积为20mL；有活化系统组取10mL细胞悬液，加入2mL试验或对照样品以及S9混合液1ml，加入含血清培养基至终体积为20mL。将上述各种混合液置于37℃振荡培养4h，振荡频率为70r/min～80r/min。注：若无活化系统组在接触4h后结果为阴性，宜延长至24h。10.1.30d的平板接种效率（PE）平板将10.1.2混合液以200g离心5min，去除上清液，用无血清RPMI1640培养基洗涤细胞两次，用含20%血清的RPM1640培养基梯度稀释至细胞数量为8个/mL，接种96孔板，每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为1.6个）。每种剂量接种两块平板。将平板放置于CO，培养箱37℃培养10d～12 d。
集落计数
目视或在显微镜及其他适宜用具下观察计数各平板无集落生长的孔数。10.1.5
数据处理
按11.111.5中的式（1)、式（2）、式（3）、式（4)、式（5)计算PE、RS或RTG。10.2主试验
10.2.1接触处理
同10.1.2。
10.2.2表达
将上述各种混合液以200g离心5min，去除上清液，用无血清RPMI1640培养基洗涤细胞两次。5
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重新悬浮于含10%血清的RPMI1640培养基中，建议调整细胞浓度为3×10.个/mL，37℃培养2d。于24h时检查细胞浓度并调整为3×105个/mL。10.2.3平板制备
按下列方法制备各组微孔平板。10.2.3.1第1天的平板接种效率（PE）：取10.2.1接触处理后离心重悬的细胞悬液，用含20%血清的RPML1640培养基梯度稀释至细胞数量为8个/mL，接种96孔板.每孔加0.2mL（即每孔平均细胞接种数为1.6个）。每种剂量接种两块平板。10.2.3.2第2天的平板接种效率（PE，）：第2天表达培养结束后，取适量细胞悬液.按10.2.3.1所述方法接种96孔板，每种剂量接种两块平板。10.2.3.3TFT拮抗平板：第2天表达培养结束后取适量细胞悬液·用含20%血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1X10个/mL，加人TFT（三氟胸苷，终浓度为3μg/mL），混匀，接种96孔板，每孔加0.2mL(即每孔平均细胞接种数为2000个）。每种剂量接种两块平板。将全部平板放置于CO，培养箱37℃培养10d~12d。
集落计数
目视或在显微镜及其他适宜用具下观察计数各平板无集落生长的孔数。若试验组结果为阳性，宜至少记录最高浓度阳性组以及阴性对照和阳性对照的大小集落数。若试验组结果为阴性，宜记录阴性对照和阳性对照的天小集落数。突变集落按大集落（LC：直径≥1/4孔径，薄层分布，密度低）和小集落（SC：直径<1/4孔径，呈块状，密度高）分别计数，极小集落可再继续培养3d后计数。11
数据处理
11.1平板效率（PE。和PE2）
按式(1)分别计算PE。和PE.。
-In(EW/TW)
式中：
平板效率，PE或PE；
EW—无集落生长的孔数：
平板总孔数：
每孔接种细胞数
相对存活率（RS）
按式（2)计算相对存活率。
式中：
一相对存活率，RS或RS2
试验样品组平板效率；
阴性对照组平板效率。
11.3相对悬浮生长率（RSG）
按式（3)计算相对悬浮生长率。6
.（2）
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