【SN商检标准】 四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3580—2013
四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR检测方法
Detection and identification of four kinds of soybean fungaldiseaseswithmultiplexreal-timePCR2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草SN/T3580-2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、辽宁省农业科学研究院
本标准主要起草人：章桂明、王颖、程颖慧、郑耘、陈枝楠、缪建锟1范围
四种大豆危险性真菌多重实时荧光PCR检测方法
SN/T3580—2013
本标准规定了大豆上的危险性真菌一一大豆疫霉病菌（Phytophthorasoiae）、大豆北方茎溃疡病菌（Diaporthephaseolorumvar.caulivora）、大豆南方茎溃疡病菌（Diaporthephaseolorumvar.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌（Phomopsislongicolla）的多重实时荧光PCR检测鉴定方法。本标准适用于大豆上的大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌以及大豆夹杂的土壤等传带大豆疫霉病菌的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法3原理
根据大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌的分子生物学特性，设计其各自的特异性引物和探针。探针的5标记为不同的荧光报告基团，3端标记为荧光率灭基团，通过寡核酸连接进行荧光谐振能量传递。在扩增反应中，由于扩增酶的5端外切酶作用将与模板匹配的探针切割，使两个基团分开，在一定激发光条件下，荧光基团发出自身波长的光，不同的荧光信号标记类型其需要的激发光条件不同，能够被收集到的荧光信号也有所不同，从而实现多重检测，4仪器、用真及试剂
4.1仪器及用具
烘箱、高压火菌锅、天平（感量1/100，1/10000）、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水机、旋涡振荡机，台式离心机、高速冷冻离心机、真空抽干机、冰箱、超净工作台、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5uL，2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)离心管(0.2mL.1.5mL.2.0mL),Tip头(0.1μL~10μL,5μL~200μ,100μl~1000μL)。4.2试剂
PDA培养基、V8培养基、水琼脂培养基、实时荧光PCR反应缓冲液、CTAB提取缓冲液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异内醇、无水乙醇、RNA酶、液氮。SN/T3580—2013
5病原菌分离培养
大豆疫霉病菌的分离按照SN/T1131进行，大豆南、北方茎溃疡病菌的分离按照SN/T1899进行：其他病菌可通过对病残体进行保湿培养、士壤选择性培养等方法，分离病原真菌。6多重实时荧光PCR检测
6.1核酸的制备
制备步骤如下：
a）取适量菌丝，加液氮研磨
后置于2mL的离心管中.迅速加人1.5ml预热的CTAB抽提液，在65℃水浴锅中水浴30wwW.bzxz.Net
mu期间不断振荡-16coog离心15min：取上清液，加人RNascA酶解（终浓度为10mg/L37水浴30min，加人等体积Tris饱和b)
酚，充分混勾，16000g离心15min：取上清液，加人等体积的三氯甲烷异成醇（24
混匀，16000g离心15min；重复1次；复据勾，4℃的冰箱中静置30min，16000g离心；d)
取上清液，加人等体积的异丙醇（预冷），反e)
小心弃去上清液，加人70
m去上清液，重复2次；
uL的去离子水充分溶解，一20℃得到DNA沉淀用冷冻干爆仪干燥干燥后加大50μ一100冰箱中保存
注：也可采用DNA提取试剂盒提取格6.2实时荧光PCR检测
6.2.1引物及探针序列
引物及探针序列见表1。
病原菌名称
大豆疫霉病菌
大豆北方茎溃疡病菌
大豆南方茎溃疡病菌
大豆拟基点种腐病菌
6.2.2扩增体系
引物及持
深针序列
皮探针厅
AGACGGCAGAC
SATTTCAA
Ps-P:NEP-TTO
GGACTC
GGCCT-NEH
Dpc-F:GCTTGGTGTTGGGGCACT
DpC-R:TACGCTCGGGGTCCTGG
Dpc-P.MAR-TGAAATTCATTGGCGAGCT-MARDPm-F:CCAGAAACCCTTTGTGAACTC
Dpm-R:TGTTTTTTGCTCAGAGTTTCG
DPM-P:JUP-ACAAGAGTTGGCTTGGC-JUPPLF.AGCATCACTTTCATTCCCACTT
PLR:GGCTGTGTAGAAAGAGTCAGCAT
PIP:URA-TCTGCTCCAGAGAGCTT-URA产物片段大小/bp
扩增反应的各成分为：实时荧光PCR反应缓冲液10μlL,Ps-F/R引物各0.3umol/L,Ps-P探针2
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SN/T3580—2013
0.3μmol/L;Dpc-F/R引物各0.5μmol/L,Dpc-P探针0.25μmol/L，Dpm-F/R引物各0.25umol/L，Dpm-P探针0.25μmol/L;Pl-F/R引物各0.3μmol/LPI-P探针0.3μmol/L；模板DNA2μL(10ng~100ng）。反应总体积为20μL。将反应体系混匀后置于实时荧光PCR仪中进行反应。以灭菌去离子水为空白对照，以大豆疫霉病菌、大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌的DNA模板为阳性对照，以不含有大豆疫霉病菌、大豆北方茎渍疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌的DNA模板为阴性对照，每个样品重复2次。6.2.3扩增条件
94℃预变性10min：94℃变性15s55℃退火60s，10次循环，94℃变性15s，60℃退火60s，40次循环，在60℃退火时收集不同通道的荧光信号。实验质量控制按照GB/T6682及SN/T1193进行。7
结果判定
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，则：待测样品对应的所有荧光信号Ct值大于或等于40，则可判定该样品未检出上述病菌；待测样品对应的NEP荧光信号Ct值小于或等于36，则判定该样品含有大豆疫霉病菌；一待测样品对应的MAR荧光信号Ct值小于或等于36.则判定该样品含有大豆北方茎溃疡病菌；
一待测样品对应的JUP荧光信号Ct值小于或等于36，则判定该样品含有大豆南方茎溃疡病菌；待测样品对应的URA荧光信号Ct值小于或等于36，则判定该样品含有人豆拟茎点种腐病菌；
实时荧光PCR所获结果中待测样品检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增再次扩增的结果如果Ct值小于或等于36或者Ct值大于或等于40，判定同上；如果检测Ct值仍在36~40之间，则需要进行形态学鉴定。8样品与原始数据保存
样品保存
存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月。如发现上述病菌，该样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。保存期满后，需经灭菌处理。保存的样品由鉴定人标识确认、样品管理员登记，进行防虫处理后，置放于干爆、防虫、防鼠处保存，保存期为1年，有特殊需求保存期可适当延长。保存期满，经灭活后妥善处理。8.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁9菌种保存
将大豆上分离到的上述四种真菌，转入PDA斜面培养基上，置于5℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。
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