【SN商检标准】 牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4822—2017
牛尿苷酸合酶缺乏症
荧光定量PCR检测方法
Detection method of deficiency of uridine monophosphate synthase by RT-PCR2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。SN/T4822—2017
本标准主要起草人：李红权、孙良娟、张娜、刘中勇、谢艳辉、吴晓薇、李家侨、周广彪、朱事康、朱道中、马保华、刘志玲、林志雄、鱼海琼。I
1范围
牛尿苷酸合酶缺乏症
荧光定量PCR检测方法
本标准规定了牛尿苷酸合酶缺乏症荧光定量PCR检测的操作方法。本标准适用于牛尿苷酸合酶缺之2规范性引用文件
艺附录A的盗测、诊断和鉴定。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的SN/T4822—2017
是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
RT-PCR
每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数（cyclethreshold）尿苷酸合酶缺乏症(defic
ency of aridine monophos
phate synthase)www.bzxz.net
ime fluorescence quantitative PCR)实时荧光定量PCRC
Crealti
单核苷酸多态性（single
nucleofide polymorphism)
4试剂和与材料
4.1苯酚(CH。O)。
4.2三氯甲烷（CHCI）。
4.3异戊醇[（CH.），CHCH,CH,OH4.4苯酚-三氯甲烷-异戊醇：饱和过的重蒸酚：三氯甲烷：异戊醇按25：24：1的比例混合。4.5蛋白酶K裂解液（10mg/mL）：将100mg蛋白酶K溶解于10mL灭菌蒸馏水中，保存在一20℃待用，避免反复冻融
4.6SDS溶液：用900mL水溶解200g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加浓盐酸调节pH值至7.2，加水定容到1000mL，室温保存
4.7DNA提取纯化试剂盒。
荧光定量PCR试剂盒（RealtimePCRMasterMix），购于试剂公司或其他等效试剂盒。4.9灭菌ddH20。
4.10引物和探针（浓度均为10μmol/L）。Fl:5'-ttctgaatttgtgattggttttat-3Rl.5\-cctcctgcttctaactgaactc-3\probe-W5'-VIC-ctggctcCgagtaagca-BHQ-3probe-M.5'-FAM-ctggctcTgagtaagca-BHQ-3\SN/T4822—2017
5仪器与设备
荧光定量PCR仪。
5.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）。5.3普通台式离心机（离心速度3000r/min）。5.41.5mLEppendorf管。
微量移液器（0.5μ~105~20μL0μ~200μ、100μ~1000μ）。5.5
5.6肝素钠抗凝管。
生物安全柜。
5.8冰箱：4℃±1℃，-20℃±2℃。6
操作方法
样品采集和基因组的提取
血液采集
采用5mL真空肝素钠抗凝管，采集到血液后摇勾，使血液和抗凝剂混合均匀，以防血凝块的形成。6.1.2质控设置
阴性对照：以不含DUMPS基因的正常牛血样本DNA模板为阴性对照。阳性对照：以含有目的基因序列的牛血DNA为PCR反应的模板，或采用含有目的基因的质粒为阳性对照。
空白对照：包含除了测试样品DNA模板以外所有的反应试剂，在PCR反应体系中用相同体积的灭菌ddHO代替模板DNA
6.2DNA模板的提取
6.2.1酚-三氯甲烷-异戊醇法
取采集的血液100μL，加人400μL的0.01mol/L的PBS(见附录B)，然后加人蛋白酶K至终浓度100μg/mL和20%SDS至终浓度10g/L，55℃水浴2h，用苯酚、苯酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（体积比为25：24：1）、三氯甲烷各抽提1次，吸取上层水相，加人1/10体积3mol/L的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀后置一20℃沉淀1h，4℃条件下12000r/min离心15min，弃掉上清液，沉淀挥干后溶解于灭菌ddH.O中，4℃保存备用。6.2.2等效核酸提取法
市场提供的符合相应质量要求的试剂盒和仪器以及配套的试剂均可用于本标准中样品核酸的提取，提取步骤按照产品提供的操作程序进行。6.3荧光定量PCR反应
6.3.1荧光定量PCR反应体系配制荧光定量PCR反应体系（30uL）见表1，每个样品设置2个平行。2
2xMix buffer
上游引物（F）
下游引物（R）
模板DNA
6.3.2荧光定量PCR扩增
表1实时荧光PCR反应体系
将加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。第一阶段，预变性94℃3min；
第二阶段，扩增94℃/305，55℃/305，72℃/305，40个循环。体积/μL
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ReportDye设置为FAM和VICQuenchDye都设定为BHQ，ReferenceDye设定为None荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时进行。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
7结果判定
7.1结果分析条件设定
直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器的噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准。具体根据仪器的噪音情况进行调整，选择FAM和VIC通道进行分析。7.2
质控标准
选择FAM和VIC通道进行分析，对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤3O，并且出现典型的扩增曲线。野生型对照出现一条扩增曲线，为VIC的典型扩增曲线；突变型质粒（T/T型）对照出现一条扩增曲线，为FAM的典型扩增曲线：杂合型对照出现两条典型扩增曲线，为FAM和VIC的扩增曲线：阴性对照不出现扩增曲线，不符合上述对照质控标准的结果视为无效。7.3样品结果判定
若检测样品出现一条VIC探针扩增曲线，Ct值≤30，并且出现特定的扩增曲线，则判定样品为DUMPS的野生型，被检测的牛为正常个体。若检测样品出现一条FAM探针扩增曲线，Ct值30，并且出现特定的扩增曲线，则判定样品为DUMPS突变型，被检测的牛为纯合子个体。若检测样品两个探针出现两条扩增曲线，为FAM探针和VIC探针扩增曲线，Ct值≤30，并且出现特定的扩增曲线，则判定样品为DUMPS的杂合子，是DUMPS疾病的携带者。若待检样品扩增曲线Ct值介于30和35之间时，应重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值≥35时，则判断探针扩增阴性。若重新检测的Ct值仍介于30和35之间，则判断探针扩增阳性，再依据不同探针进行DUMPS野生型和突变型区分。3
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附录A
（资料性附录）
疾病概述
尿苷酸合酶综合症（DUMPS）是荷斯坦奶牛群中较常见的一种常染色体单基因突变的隐形遗传疾病，可导致隐形纯合的后代胚胎早期死亡，病因是由于牛1号染色体（BTA1）上的DUMPS基因C-末端密码子405处存在着一个C-T点突变造成的隐性缺陷遗传病。利用新型荧光定量PCR检测SNP的技术，PCR扩增时，在加入一对引物的同时加人一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一
完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶5°-3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和率灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成的完全同步。进行SNP(singlenucleotidepolymorphism）检测时，针对SNP位点不同的碱基序列设计不同的Taqman探针，在扩增过程中，只有与靶序列完全匹配的探针才能被切割，释放荧光信号。依据隐性缺陷遗传病C→T点突变序列分别设计两个探针，标记不同的荧光吸收信号，随着PCR反应的扩增，PCR产物和荧光信号的增长呈现出正向对应关系。S
磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)配方
附录B
（规范性附录）
试剂配制
以下所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682要求，A液（o.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）磷酸二氢钠（NaHzPO.·H.O)27.6g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000mL。B液（o.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：磷酸氢二钠（NazHPO,·7HO)53.6g（或NazHPO蒸馏水溶解，最后稀释至1000mL0.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水的配制：0.2mol/LA液
0.2mol/LB液
氯化钠(NaCI)
用蒸馏水稀释至1000mL。
SN/T4822—2017
12H,071.6g或NazHPO,·2H035.6g)，加S
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