【国家标准】 食品安全国家标准 食品添加剂 乳酸链球菌素

中华人民共和国国家标准
GB1886.231—2016
食品安全国家标准
食品添加剂
2016-08-31发布
乳酸链球菌素
2017-01-01实施
人民共和国
国家卫生和计划生育委员会
1范围
食品安全国家标准
食品添加剂
乳酸链球菌素
GB 1886.231—2016
本标准适用于经乳酸乳球菌（Lactococcuslactissubsplactis）发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素。
2分子式、结构式和相对分子质量2.1分子式
Ci4H23oON42S,(NisinA)
Ci4H22gO3sNS,(NisinZ)
结构式
H— Ile -
HO—lys—Dha
Val—is-
(Asn)llis
Ala—Lcu
As1120
NisnA：第27位氨基酸为组氨酸(His);NisnZ.第27位氨基酸为天冬酰胺（Asn）2.3
相对分子质量
NisinA：3354.35（按2013年国际相对原子质量）NisinZ：3330.31（按2013年国际相对原子质量）3技术要求
感官要求
感官要求应符合表1的规定。
理化指标
浅棕色至乳白色
理化指标应符合表2的规定。
效价/（IU/mg）
干燥减量，w/%
氯化钠，/%
铅（Pb)/（mg/kg）
感官要求
检验方法
GB1886.2312016
将适量试样均匀置于白瓷盘内，在自然光线下观察其色泽和状态
理化指标
检验方法
附录A中的A.3
GB/T5009.42
GB5009.75
注：商品化的乳酸链球菌素产品应以符合本标准的乳酸链球菌素为原料，可添加氯化钠、乳固体等辅料而制成，其效价符合声称
微生物指标
微生物指标应符合表3的规定。
3微生物指标
菌茵落总数/（CFU/g）
大肠菌群/(MPN/g）
大肠埃希氏菌/（MPN/g）
沙门氏菌
不得检出
检验方法
GB4789.38
A.1一般规定
附录A
检验方法
GB1886.231—2016
本标准除另有规定外，所用试剂的纯度应为分析纯，所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，应按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备.试验用水应符合GB/T6682中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液A.2鉴别试验
试剂和材料
盐酸溶液：0.02mol/L。
氢氧化钠溶液：5mol/L。
脱脂牛奶：脂肪含量<1%。
石蕊牛奶培养基。
A.2.1.5检测菌：乳酸乳球菌（ATCC11454，NCIMB8586）。A.2.2
分析步骤
试样储备液制备
取1g试样，溶于1L盐酸溶液中，溶液效价约为1000IU/mLA.2.2.2对酸溶液的稳定性试验
用盐酸溶液将试样储备液稀释至约50IU/mL，制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5min，按效价测定方法测煮沸过的试样溶液中Nisin效价。计算煮沸过的试样中Nisin的效价，计算结果在其效价值的（100%±5%)内，表明无显著活性损失。A.2.2.3对碱溶液的稳定性试验
用盐酸溶液将试样储备液稀释至约50IU/mL，制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5min，用氢氧化钠溶液调pH至11.0将溶液加热到65℃保持30min，冷却。然后滴加盐酸调pH至2.0，用效价测定方法测定最终溶液中Nisin的效价。在按照上述操作处理后会出现抑菌活性的几乎完全损失。A.2.2.4不同抑菌物质中Nisin的鉴别A.2.2.4.1乳酸乳球菌的培养：乳酸乳球菌（工作菌株）（ATCC11454.NCIMB8586）在无菌脱脂牛奶中培养，30℃培养18h。
A.2.2.4.2准备1个或多个装有100mL石蕊牛奶培养基的长颈烧瓶，在121℃灭菌15min，将0.1g试样加人该无菌的石蕊牛奶培养基中混勾，在室温下静置2h后加入0.1mL检测菌，30℃下培养24hbzxz.net
A.2.2.4.3检测菌（乳酸乳球菌）可在该效价的试样（约1000IU/mL）中生长，但不能在相似浓度的其他抑菌物质中生长。
A.3效价的测定
A.3.1试剂和材料
A.3.1.1乳酸链球菌素标准品（效价：1×10°IU/g）。A.3.1.2盐酸溶液：0.02mol/L
A.3.1.3吐温溶液：吐温20：水=1：1。GB1886.231—2016
A.3.1.4培养基（S）：胰蛋白陈0.8%；酵母膏0.5%；葡萄糖0.5%；氯化钠0.5%；磷酸氢二钠0.2%；琼脂粉1.2%~1.5%，灭菌后pH6.8~7.0A.3.1.5检测菌：黄色微球菌（NCIB8166）A.3.2分析步骤
检测菌（NCIB8166）的培养及菌悬液的制备A.3.2.1.1检测菌的培养
用无菌接种环从甘油管或冻干管中取一环检测菌（NCIB8166），接种在无菌的S平血上，进行自然分离，挑出饱满、边缘光滑的菌落，扩大，接在S，的试管斜面上，在30℃恒温箱中培养24h，放入2℃～5℃冰箱中。
A.3.2.1.2菌株悬浮液的制备
取在冰箱中的检测菌（NCIB8166），用无菌生理盐水洗脱下来，制成10°CFU/mL浓度的细胞悬液，备用。
A.3.2.2平板的制备
配制S，培养基200mL（按比例先把琼脂溶化，依次加入各组分溶解，磷酸氢二钠溶解后加人），经121℃20min灭菌后，放冷至70℃左右，加人4mL吐温20溶液，充分摇勾，等冷却到50℃～55℃左右，加入已制备好的菌株悬浮液适量，使培养基中检测菌的最终浓度为1.0×10个/mL，摇匀，倒人水平放置的已灭菌的平板中，等完全凝固后，用直径为7mm打孔器，在平板上打出所需的孔数，小心挖掉孔内琼脂，移入洁净工作台中吹风1.5h3.0h（吹风时间按空气中的湿度大小而定，同时控制室内温度最低，尽量不要让检测菌生长），吹干后，置2℃～5℃冰箱中，到次日使用。A.3.2.3标准品溶液的制备
准确称取乳酸链球菌素标准品（精确到0.0001g），溶于盐酸溶液中，使最终浓度为2mg/mL（2000IU/mL），摇匀.用盐酸稀释成300倍、600倍，即成高、低剂量标准溶液，A.3.2.4试样溶液的制备
称取一定量的试样（精确到0.0001g），用盐酸溶液溶解后，稀释成高、低剂量试样溶液，其乳酸链球菌素含量，按估计单位高、低剂量与标准品溶液大致相当。A.3.2.5滴加溶液
取出存放在冰箱中的平板，用移液器，取70L～80uL标准品高剂量溶液，随机滴加在平板的孔中，滴6个孔，再取70μL～80uL标准品低剂量溶液.随机滴加在与高剂量溶液同一平板其余孔的6个孔中。
试样溶液和标准品溶液滴在同一平板上，其操作同标准品A.3.2.6
恒温培养
GB1886.231-2016
等孔内的溶液渗透完全后，移人30℃恒温箱中培养16h24h后.测量抑菌圈直径，A.3.3
结果计算
用卡尺测量抑菌圈直径，取其平均值，按式（A.1)计算效价：CsH=CBHXk+XhL+）
式中：
试样溶液的效价，单位为国际单位每毫克（IU/mg）；CSH
标准溶液的效价，单位为国际单位每毫克（IU/mg）；高剂量试样溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；低剂量试样溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；高剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；低剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；X
高剂量与低剂量浓度的比值。
若试样估计值不在测定值的90%～110%范围内，需重新估计试样效价，重测.（A.1)
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