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- DB21/T 2826-2017O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法
标准号：
DB21/T 2826-2017
标准名称：
O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法
标准类别：
辽宁省地方标准(DB21)
标准状态：
现行-
发布日期：
2017-11-16 -
实施日期：
2017-12-16 出版语种：
简体中文下载格式：
.pdf .zip下载大小：
1.11 MB
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标准简介：
整理后的DB21/T2826-2017《O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法》辽宁省地方标准。内容涵盖标准范围、规范性引用文件、材料与试剂（仪器、试剂、引物序列）、抽样规范、样品采集与制备、样品存放及操作方法等。适用于动物及其产品中O型口蹄疫病毒的快速筛查。
标准内容部分标准内容：
ICS 11.220
B41
备案号：58552-2018
DB21
辽宁省地方标准
DB21/T 2826-2017
O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法
2017-11-16 发布
2017-12-16 实施
辽宁省质量技术监督局 发布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为资料性附录。
本标准由辽宁省畜牧兽医局提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。
本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院。
本标准主要起草人：李井春，曹东，申贯男，梁介，张健，高志峰，李红料，赵培，印宝东，王克，有玉晟。
1 范围
本标准规定了O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测的操作方法。
本标准适用于动物及其产品中O型口蹄疫病毒的快速筛查。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 22915 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法
GB/T 6682 分析实验室用水
3 RT-LAMP
3.1 材料与试剂
3.1.1 仪器与器材
浊度分析仪或水浴锅，计时器，高速台式冷冻离心机，离心速度达12000 rpm/min以上，台式离心机，离心速度达3000 rpm/min以上，混匀器，冰箱，微量可调移液器，含10 μL、100 μL、1000 μL量程及配套带滤芯吸头，1.5 mL Eppendorf管。
3.1.2 试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有分装试剂均用无RNA酶污染的容器盛装，容器用DEPC水处理后高压灭菌，DEPC水配制方法见附录A。
病毒总RNA提取试剂Trizol；氯仿：-20℃预冷；异丙醇：-20℃预冷；PBS：配制方法见附录B，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL；75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，符合GB/T 6682-2008要求，-20℃预冷；灭菌生理盐水；DEPC水及ddH₂O；RT-LAMP检测试剂盒；目视检测试剂盒；
阴性、阳性对照：阳性对照使用兰州兽医研究所O型液相抗体检测试剂盒中的病毒抗原对照，阴性对照使用DEPC水；
引物：根据下载的O型FMDV保守基因区域，设计合成RT-LAMP引物，序列见表1。
表1 RT-LAMP引物及序列
引物名称：F3
引物序列：5'-CGTGTGGGATGTGGACTAC-3'
引物名称：B3
引物序列：5'-CGGCATTCCACCTTCAACA-3'
引物名称：FIP
引物序列：5'-CGTGCGGAACACTTCCTCGAACTCAGCCTTTGATGCAAACCA-3'
引物名称：BIP
引物序列：5'-TTCGGATTCCACCCGAACGCACAATGCGCTTGTTCTCGTA-3'
3.2 抽样
按GB/T 22915方法进行。
3.2.1 采样工具
应配备下列采样工具：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf管、研钵，以上工具必须经21±2℃，15 min高压灭菌并烘干。
3.2.2 样品采集
3.2.2.1 采集的样品主要为水泡皮、水泡液、血液、口腔分泌物和组织，采集后立即冷藏送检或置于含抗生素PBS的灭菌管内低温保藏，编号并作好记录。
3.2.2.2 水泡液及水泡皮：用75%的酒精轻轻消毒水泡表皮；去掉污物后用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素PBS管内，编号，冷藏或送检。水泡液采取后，将水泡皮剪下，放入含抗生素PBS的灭菌管内，编号，冷藏或送检。
3.2.2.3 口腔分泌物和咽拭子：用棉拭子或探针刮取咽喉液体，放入含抗生素PBS的灭菌管内，编号，冷藏或送检。
3.2.2.4 血液：用真空管或无菌注射器直接采取至无菌的Eppendorf管或其他灭菌容器，编号，冷藏或送检。
3.2.2.5 肌肉或组织脏器：用无菌器械采集，放入灭菌容器，编号，冷藏或送检。
3.2.3 样品转运
样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品放一个塑料袋，保温箱中加冰、密封送实验室。
3.2.4 样品制备
3.2.4.1 水泡液、血液和口腔分泌液样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
3.2.4.2 水泡皮、肌肉或组织脏器：取检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4℃，3000 rpm/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
3.2.5 样品存放
制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融，冻融不超过3次。
3.3 操作方法
3.3.1 样品的处理
（注：原文在此处截断，后续内容未提供）
B41
备案号：58552-2018
DB21
辽宁省地方标准
DB21/T 2826-2017
O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测方法
2017-11-16 发布
2017-12-16 实施
辽宁省质量技术监督局 发布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A为资料性附录。
本标准由辽宁省畜牧兽医局提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。
本标准负责起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院。
本标准主要起草人：李井春，曹东，申贯男，梁介，张健，高志峰，李红料，赵培，印宝东，王克，有玉晟。
1 范围
本标准规定了O型口蹄疫病毒RT-LAMP检测的操作方法。
本标准适用于动物及其产品中O型口蹄疫病毒的快速筛查。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 22915 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法
GB/T 6682 分析实验室用水
3 RT-LAMP
3.1 材料与试剂
3.1.1 仪器与器材
浊度分析仪或水浴锅，计时器，高速台式冷冻离心机，离心速度达12000 rpm/min以上，台式离心机，离心速度达3000 rpm/min以上，混匀器，冰箱，微量可调移液器，含10 μL、100 μL、1000 μL量程及配套带滤芯吸头，1.5 mL Eppendorf管。
3.1.2 试剂
除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有分装试剂均用无RNA酶污染的容器盛装，容器用DEPC水处理后高压灭菌，DEPC水配制方法见附录A。
病毒总RNA提取试剂Trizol；氯仿：-20℃预冷；异丙醇：-20℃预冷；PBS：配制方法见附录B，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL；75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，符合GB/T 6682-2008要求，-20℃预冷；灭菌生理盐水；DEPC水及ddH₂O；RT-LAMP检测试剂盒；目视检测试剂盒；
阴性、阳性对照：阳性对照使用兰州兽医研究所O型液相抗体检测试剂盒中的病毒抗原对照，阴性对照使用DEPC水；
引物：根据下载的O型FMDV保守基因区域，设计合成RT-LAMP引物，序列见表1。
表1 RT-LAMP引物及序列
引物名称：F3
引物序列：5'-CGTGTGGGATGTGGACTAC-3'
引物名称：B3
引物序列：5'-CGGCATTCCACCTTCAACA-3'
引物名称：FIP
引物序列：5'-CGTGCGGAACACTTCCTCGAACTCAGCCTTTGATGCAAACCA-3'
引物名称：BIP
引物序列：5'-TTCGGATTCCACCCGAACGCACAATGCGCTTGTTCTCGTA-3'
3.2 抽样
按GB/T 22915方法进行。
3.2.1 采样工具
应配备下列采样工具：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL Eppendorf管、研钵，以上工具必须经21±2℃，15 min高压灭菌并烘干。
3.2.2 样品采集
3.2.2.1 采集的样品主要为水泡皮、水泡液、血液、口腔分泌物和组织，采集后立即冷藏送检或置于含抗生素PBS的灭菌管内低温保藏，编号并作好记录。
3.2.2.2 水泡液及水泡皮：用75%的酒精轻轻消毒水泡表皮；去掉污物后用灭菌生理盐水擦去酒精，然后用注射器穿刺水泡吸取水泡液，置于含抗生素PBS管内，编号，冷藏或送检。水泡液采取后，将水泡皮剪下，放入含抗生素PBS的灭菌管内，编号，冷藏或送检。
3.2.2.3 口腔分泌物和咽拭子：用棉拭子或探针刮取咽喉液体，放入含抗生素PBS的灭菌管内，编号，冷藏或送检。
3.2.2.4 血液：用真空管或无菌注射器直接采取至无菌的Eppendorf管或其他灭菌容器，编号，冷藏或送检。
3.2.2.5 肌肉或组织脏器：用无菌器械采集，放入灭菌容器，编号，冷藏或送检。
3.2.3 样品转运
样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品放一个塑料袋，保温箱中加冰、密封送实验室。
3.2.4 样品制备
3.2.4.1 水泡液、血液和口腔分泌液样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
3.2.4.2 水泡皮、肌肉或组织脏器：取检样品2.0 g于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10 mL PBS混匀，4℃，3000 rpm/min离心15 min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。
3.2.5 样品存放
制备的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h，若需长期保存应置-70℃以下，但应避免反复冻融，冻融不超过3次。
3.3 操作方法
3.3.1 样品的处理
（注：原文在此处截断，后续内容未提供）
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