【行业标准】 国境口岸鼠类携带病原体检测方法 第1部分致病性钩端螺旋体PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3741.12013
国境口岸鼠类携带病原体检测方法第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法Detection for pathogens of rodents at frontier ports-Part1:Detectionforpathogenicleptospira2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3741《国境口岸鼠类携带病原体检测方法》共分为2部分：第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法；第2部分：土拉弗朗西斯菌PCR检测方法本部分为SN/T3741的第1部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T 3741.1-2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：孙肖红、张述铿、宋锋林、刘丽娟、刘键、高博、杨宇、胡孔新、王静1范围
国境口岸鼠类携带病原体检测方法第1部分：致病性钩端螺旋体PCR检测方法SN/T3741.1—2013
SN/T3741的本部分规定了国境口岸鼠类样本采集、处理方法、致病性钩端螺旋体PCR检测的方法和结果判定，
本部分适用于国境口岸鼠类携带病原体检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
鼠类rodent
与鼠传疾病有关的鼠形动物（包括啮齿目、免形目和食虫目动物）。3.2
钩端螺旋体leptospira此内容来自标准下载网
简称钩体，是一大类菌体纤细、螺旋致密，一端或两端弯曲呈钩状的螺旋体，其中一小部分为致病性钩端螺旋体，可引起人和动物钩端螺旋体病（简称钩体病）。钩体病是世界范围流行的一种人兽共患病，主要传染源是鼠类和猪。我国有28个省、市、自治区发现本病。人类感染除极个别来自实验室感染外：均因接触受染动物排出到环境中的致病性钩端螺旋体所致。4要求
鼠类携带病原体检测应在生物安全2级以上实验室（BSL-2）内进行。实验室应遵循GB19489对生物安全2级及以上实验室的生物安全要求。5实验仪器设备
本方法使用的主要仪器如下：
高速台式冷冻离心机：
一组织研磨仪；
生物安全柜；
—电泳仪；
SN/T3741.1-2013
凝胶成像系统：
PCR仪：
微量加样器（10μL20L、100uL200L1000uL）：冰箱（2℃~8C和-20℃~-80℃）
6主要试剂
6.1核酸提取试剂：组织DNA提取试剂使用天根公司TIANampGenomicDNAkit\。6.2PCR试剂：dNTP10XPCR缓冲液Tap酶使用TAKARA公司产品。6.3引物：上游引物PI序列（532）GACCCGAAGCCTGTCGAG，下游引物P2序列（5-3）：GCCATGCTTAGTCCCGATTAC护增产物长度为500bP6.4氧化锆颗粒（直径3mm）。
6.5RPM1640培养液
PCR检测
7.1样本DNA的提取
按照附录A进行。
7.2反应体系的配制
在200μL的PCR反应管中依次加人下列试剂灭菌双蒸水14.35L、10×PCR缓冲液2μL、dNTP(2.5mmol/L)0.5μL、10μmol/游引物05aL10mol/下游引物0.5μL、(5U/uL)Tap酶0.15L，模板DNA2μL，总体积为20L。设阴性对照阳性对照和空白对照。将配制完成的反应体系瞬时离心，放入PCR仪。
7.3反应条件
PCR反应条件为95℃5min预变性，94/30s57℃457260s40个循环，72℃10min。7.4结果判定
取5LPCR产物进行2%琼脂糖电泳依下列标准判断在阴性对照、空白对照未出现条带，阳性对照出现500bp扩增条带情况下，如待测样品未出现相应大小的扩增条带，则可报告该样品未检出致病性钩端螺旋体基因片段：如待测样品出现500bp扩增条带则可判定该样品检出致病性钩端縣旋体基因片段如果阴性对照、空白对照出现条带和(或)阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新检测，并排除污染因素。13由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可：如果其他等效产品具有相回的效果，则可以便用这些等效产品。2
A.1鼠类标本采集
A.1.1取材范围
附录A
（规范性附录）
鼠类脏器标本采集、处理方法
在口岸地区本底调查或监测范围内捕获的鼠类或在该范围内收集的自鼠类A.1.2取材方法
SN/T3741.1—2013
A.1.2.1将获得全部应检鼠类分类、编号登记，单只装人鼠袋内，活鼠麻醉或处死后，分栋体表寄生虫，并分类鉴定，然后解剖采样。
A.1.2.2自、染病菱靡鼠类，按照常规方法解部后，取肾脏，装人2mL.细胞冻存管中，尽快送检或低温保存。
A.2检测用鼠脏器的处理方法
A.2.1致病性钩端螺旋体核酸检测的样品处理A.2.1.1组织样品的研磨
取30mg肾脏，用生理盐水洗一次，置2mL的圆底离心管中，加人3颗直径3mm的氧化题粒，再加人0.5mL的RPM1640培养液，用组织研磨仪4000次/min振荡60s，直至无肉眼可见的组织块，即为组织匀浆液。
A.2.1.2组织DNA提取方法一
使用天根生物公司血液/细胞/组织基固组DNA提取试剂盒（离心柱型）。A.2.1.2.1将组织匀浆液4℃10000g离心1min，弃尽上清液。加200μLGA缓冲液，充分振荡15s，室温放置10min。A.2.1.2.2
A.2.1.2.3
A.2.1.2.4
A.2.1.2.5
A.2.1.2.6
A.2.1.2.7
A.2.1.2.8
A.2.1.2.9
振汤混匀。
加人40μlRNaseA（10mg/ml)，振荡15s，室温放置5min。加20μLProteaseK，颠倒混匀，56℃水浴3h，加200μLGB缓冲液+颠倒混匀.70℃水浴10min。加200L无水乙醇，充分振荡15s，将全部液移人柱子中，12000g，短暂离心305。弃废液，加500μLGD缓冲液：12000g离心30s。弃废液，加700μLPW缓冲液，12000g离心30s。旋涡振荡15s。加200μL缓冲液AL，旋涡振荡混匀，加200μL乙醇（96%~100%），旋涡A.2.1.2.10将得到的混合物转移至DNeasyMinispincolumn(置于2mlcollectiontube中），6000g离心1min，弃掉滤液和collectiontube。2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。SN/T3741.1--2013
A.2.1.2.11将离心柱放人新套管中，室温放置5minA.2.1.2.12向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液，室温放置2min。A.2.1.2.1312000g离心2min。收集液即为DNA。A.2.1.3组织DNA提取方法二
使用Qiagen公司的DNeasyBlood&TissueKit\。A.2.1.3.1将质量不超过25mg的组剪成碎块，置于1.5mL离心管中，加180μLATLA.2.1.3.2加20uL蛋白酶K，旋涡振荡混匀，56℃孵育（孵育过程中不时振荡以分散样品）至组织完全裂解。
A.2.1.3.3旋涡振荡158。加200μL缓冲液AL，旋涡振荡混匀，加200uL乙醇（96%~100%），旋涡振荡混匀。
A.2.1.3.4将得到的混合物转移至DNeasyMinispincolumn（置于2mLcollectiontube中），6000g离心1min，弃掉滤液和collectiontube。A.2.1.3.5将DNeasyMinispincolumn置于另一新collectiontube中，加500μL缓冲液AW1,6000g离心1min，弃掉滤液和collectiontube。A2.1.3.6将DNeasyMinispincolumn置于另一新collectiontube中，加500μL缓冲液AW220000g离心3min，弃掉滤液和collectiontube。A2.1.3.7将DNeasyMinispincolumn置于另一千净的1.5mL或2mL离心管，取200μL缓冲液AE直接加到DNeasymembrane中，室温下孵育1min，6o00g离心1min以洗脱DNA。由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具3
有相同的效果，则可使用这些等效产品。书号，155066：2-26952
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