【国家标准(GB)】 SPF鸡 微生物学监测 第6部分：SPF鸡 酶联免疫吸附试验

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T17999.6-2008
代替G13/T17999.5—1999
SPF鸡微生物学监测
第6部分：SPF鸡，酶联免疫吸附试验SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 6: Enzyme-linked immunosorbent assay for SPF chicken2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施免费标准下载网bzxz
GB/T 17999&SPF 鸡
第 1 部分:SPF 鸡
第 2 部分;SPF 鸡
第3 部分;SPF鸡
-第 4部分:SPF鸡
-第5部分:SPI鸡
第6部分：SPF鸡
-第7部分:SPF鸡
第8部分:SPF鸡
微生物学监测分为10个部分：
微生物学监测总则；
红细胞凝集抑制试验；
而血清中和试验；
血清平板凝集试验；
琼脂扩散试验；
藤联免疫吸附试验；
胚辙感试验：
鸡由痢沙门氏菌捡验；
第9部分：SPF鸡“试管凝集试验；第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验：本部分为GB/T17999的第6部分。GB/T 17999.6--2008
本部分修订鑫照了CB/118936：2003《高致病性禽流感诊断技术》.13/191672003《传染性囊病诊断技术》、VY/T538—20U2《鸡传染性案炎诊断技术.OLE陆生动物（乳动物、禽鸡和蜜蜂）诊断试验和疫苗手册（第亚版）中的有关规定本部分代替GB/T17999.5--1999&SPF鸡，酶联免疫吸附试验》。本部分与GB/T.17999.5-—1999相比主要变化如下：增加了间接海账免疫吸附试验；增加了附录A“试剂的配制”。
.本部分的谢录A为规范性附录.
本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分出全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽资研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司，
本帮分主要起草人：曲连东、姜麥、静凌霞、邵卫暴、朱果、单忠芳，刘家森、昌德、郭东春、于海波，孟庆文。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 17999. 5—1999.
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SPF鸡
：微生物学蓝测
第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验GB/T17999的本部分规定了嗨联免腰破附试验的妆咪骤求GB/T 17999.6—2008
本部分间接酶联免疫吸附试验适用于对SFI鸡逊行以下病写缴生物的血清抗体检测：刮鸡嗜血杆菌（Huemuphilus）、鸡萨支原
深Mco
禽流感病萨（AvianJalli
(Infectious Bronchitis
病毒(Reticuloendotheli
病亲(病毒性关
管炎病市（infcct
甲细胞白病病意
本分双
闽接海联
知抗体拾测末
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）.滑液原体（Mycoplasmasynomae）ue,新城疫病毒（Newcastle
rus):传染性支气管炎病萨
传染性法氏囊病病（TnJectious Burl DiscTirus)
nphoid
孵联免
附试验来来
，间接酶联免胶吸射试验
3.1.1.创被抗膜
3. 1.2 包被液、臂
3.2器材
醇标板，移腋器，
3.3操作程序
阳性对
册于对SPH
温培券箱，酶标仪。
eVirus）、网状肉皮增生症
Inferecus A
aenizVirus）含呼肠孤
icephaomyeis·Virus）传染性喉气$Adgovirus Ciroup游
细胞白筛病病糖 P2了抗原检测。抗休夹心璃跌免皮吸附试验来用山明书保接和优箱
3.3.1抗原包被：蒋腐流感病
传染性支气管炎病游、传染性氏囊病病声、传染性喉气管炎病毒、新娥疫病毒、副鸡嗜血杆菌、食膨病毒Ⅱ藓(2鸡斑克鼠棒、谱液斑菜原体、禽脑脊髓炎病萨、淋巴细胞白血病病毒、网状内皮增生症病毒呼肠孤病毒(病毒性关节鸡传染性贫血病毒抗原用位被液稀释率工作浓度，加人酶标板各孔中，每孔置冰稻过夜。3.3.2洗涤甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放罩5mi，然后用净，如此重复3次。3.3.3加被检血清：用稀释液将被检血清以1：100稀释，每孔加人100μL，每次操作均设盘阴性对照孔两个，阳性对照孔、空白对照孔各个，分别加人同样稀释的阴性血清、阳性血清和稀释液各100uL加不筒的血清样品时应换吸头，37℃温箱中作用30mitl，3. 3. 4洗涤:同 3. 3. 2 。
3.3.5加羊抗鸡IgG游标抗体：用稀释液将海标抗体稀释至上作浓度，每孔加入I00μL,37C温箱中作用 30 mit。
3. 3. 6洗涤:同 3. 3. 2.
显色：加入底物液100μL，室温避光反应5min左右（至阴性对照孔开始产牛颜色时）1
食品伙
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GB/TF 17999.6—2008
3.3.8终正及读数：每孔加50L终出液终止最色，然后用酶标仪读收每孔在490刀m处的吸光座(OD)值。
3.4结果判定与表示方法
将样品的0)值代人式(1)计算。
式中：
S被检血消样品OD值
N——阴性对服半均 OLD值。
被检血清样品(OI)值
阴性对照平岛OD值
若 S/N2则结果判为阳性,记“二”,否则判为阴性,记为“二”4双抗体夹心酶联免疫吸附试验
4.1试剂
4.1.1急被抗体（兔抗P27IgG）、性抗原(P27>、阴性抗原，被检血清、被检蛋清，IIRP-免抗P27、竿抗鸡IgG酶标抗休按说明书保存和使用。4.1.2叙被液、稀释液、底物液.终止液配制方法见附录A，4.2器材
4.3操作程序
4.3.1抗体包被：用包被液将免范P271gG作适当稀释，每孔100μL，4%过夜4.3.2洗涤：去包被液，每孔加满洗涤液（约300uL),静3min，用于如此重复3次，4.3.3加样：每孔加100l.被检强消，设阳性，阴性对照孔，个样品加两孔，37℃作用60min虑去样品，洗涤网1.3.2。
4.3.4每孔加HRP-免抗P27液（作浓度)100L，3?℃作用45min~60min，甩去HRP-免抗P2.7液，洗涤同4.3.2.
4.3.5底物溶液：每孔加100L新配制的底剪溶液，避光作用15min4.3.6终止及读数：每孔加50ul，终止液终止显色，然后用酶标仪读取每孔在490nm处的吸光度(OD)值。
5结果判定
5.1当阳性对照OID值与阴性对照OD值之差大于或等于0.3时，试验结果可靠5.2按式(2)计算被检样品的S/P比值。样品CD值均数-阴性对照OD值与数S/P -
阳性对照OD值均数二荫性对照OD值均数中：
S——样品OD值：
一阳性对照OU值
5.3判定：S/P20.2,判为阳性;S/P≤0.2，判为阴性。2
包被液
（规范性附录）
试剂的配制
碳酸盐缓神液(0. 05 mal/、pH9.6,CBS):碳酸钠
碳酸氢锅
用双蒸水溶解至10001nL，于4℃保存，不超过！个月。A.2
稀释液
磷酸盐缓河(0.01 mol/、PH7.4,PBS)：氨化钠
磷酸二氢钠
磷酸冤二钠(NaHPO.12H,O)
氯化钾
“加蒸馏水案
A.3洗涤液
命 0. 05% Tween 20 的 0. o1 mol/LpH7. 4 的PBS:Tweer-20
加 0. 0I moI/I、pH7. 4 的 PBS 至A.4
底物溶液
pI5.0,磷酸盐-柠樣酸缀冲液OPD)-HO,磷酸氢二钠液(NagHPO.12H.O)
柠檬酸
：蒸馏水
106. 4 Pa,30 min.灭菌,4 C保存备用:1. 59 g
.0. 2 g
1Q0G 1L
.50 mL
:1000 ml.
.100mt.
GB/T 17999.6—2008
使用时每100tmL中加人40邻来二胺（OPD），溶解后加30H;U，0.15mL，混句后使用，本试剂现用现配，
终止液
2 mol/L硫酸：
硫酸（95%~98%）
蒸馏水
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88, 9 mL
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GB/1 17999.62008
参考文献
GB/T18936—2003高致病性禽流燃诊断技术GB/T19167·2003传染性攀病诊断技术[2]
「37NY/T5382002鸡传染性舜炎诊断技术合体伴网htn
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