【国家标准(GB)】 SPF鸡 微生物学监测 第3部分：SPF鸡 血清中和试验

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T：17999:3--2008
代替GB/T17999.21999
SPF鸡微生物学监测
第3部分：SPF鸡血清中和试验
SPF chicken-Microbiological surveillance-Part 3: Serum neutralization test for SPF chicken2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T179996SPF鸡
，徽生物学盟测》分为10个部分第1部分;SPF 鸡
第 2 部分:SPF 鸡
第3部分SPF鸡
-第4 郝分:SPF 鸡
微生物学监测总则：
红细胞资集抑制试验，
证清中和试验；
血清平板凝集试验；
第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验；第6部分：SPF鸡
酶联免疫吸附试验；
第7部分SPF鸡
第8部分：SPH鸡
第9部分:SPF鸡
胚敏感试验；
鸡白痢沙门氏南检验，
试管證集试验；
第10部分：SPF鸡
间接免荧光试验。
本部分为GI3/T17999的第3部分：GB/T17999.3--2008
本部分修订参照O1E陆生动物（哺乳动物、禽鸟和蜜蜂）诊断试验和疫苗于册》（第五版）中的有关规定。
本部分代替CB/179.2—1999%SPF鸡：血清中和试验》。本部分与GB/T17999.21999相比主要变化如下：增加了规范性附录人“试剂的配制”、资料性附录I病毒接种技术”以及资料性附录C“鸡胚接种病毒后的病变特征”，
在试验内穿部分，增加了病毒的稀释悌度；对不同病毒致死鸡胚的时间重新确定。本部分附录A为规范性附录，附录B.附录C为资料性附录。本部分由中华人民共利国农业部提山。本部分由余国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181)归口本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫与流行病学中心、济南斯帕法斯家食有限公司，
本郝分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、姜篓、司昌德、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T17999.2—1999
品伙伴网h
SPF鸡微生物学监测
第3部分：SPF鸡
·血清中和试验
CB/T17999的本部分规定了通清中和试验的技术要求：GB/T.17999.3-2008
本部分适用于对SPF鸡进行以下病毒中和抗体的检测：禽脑咨髓炎病毒（AvianEncephalamyclitisVirus）、传染性支气管炎病牵（InfectiousB3ronchitisVirus）、传染性喉气管炎病毒中和试验系措有生物活性的病帮与相应的抗体结合后，失去原有的生物活性的中和反应：中和反成不仅有高度特异性，且具有严格的量的关系。因此可用中和试验鉴定病毒，可用子相应抗体的定量.检测。
3：试剂和器材
3.1.1°病毒：禽脑脊髓炎病毒VanRaekel株（CVCCAV35)、传染性艾气管炎病毒H52(CVCCAV1513)、传染性法氏囊病病毒A80袜（CVCVAV2321)，传染性喉气管炎病毒A96（CVCCAV200)3.1.2.病毒稀释波：胰蛋白陈磷酸盆肉离<见附录A)。?3.1.3青霉素/链霉索（双抗)腋（见附泉A）3.1.48%碘酊液。
3.1.5SPF胚蛋
3.2器村
3.2.1：蛋钻（打孔器）
3.2.26号针头。
3.2.37号针头。
混合器。
聪蛋器。
操作程序
4.1：试验准备
4.1.1＇血清样品处理
被检血清和阳性对照血清经56℃.30min~45min炎活补体；保存于二20℃茶件下备用。:4.1.2SPF胚蛋准备
照胚检查胚体活力，选取血管清晰、胚体规律摆动的健康胚蛋，每个检测项目需胚蛋24枚4.1.3稀释病毒
4.1.3.1取灭菌试管1支～9支，每管加人稀释液4mL、青垂素/链筹素液0.5mL第1管加入病毒液0.5ml.,作连续10倍稀释，各种病声的稀释度参见表1。.4. 1. 3, 2
h
wfoodmate.net
CB/T17999.3-2008
离胸脊髓炎病击
传染性支气炎病毒
传染性法医粪病病毒
传染性喉气管炎病毒
4.2中和试验
4. 2. 1 血清准各
每份被检血清需1.5mL
4.2.2病毒稀猝度选择
根据具体情况决定，
释度，如103，~10。
清样品时，病萨稀释常菜扇
4.2.3病毒与血清显餐作
将血清与不同幕
表 1 病毒稀释
稀释度
10~1--10-6
101-10-#
10-1~-6
I0-1--10-6
6个连续的病表稀释度。检测SPF鸡血清品时·病每采用较高稀挫对照血
的病毒等
避炎病萃
气管炎病击
泰优噬病病毒
熙性摄
气管炭病膝
4.2.4接种鸡胚
4.2.4.1病毒与血薄
整作后援
4.2.4.2病毒对照，激
轿释层
清与病毒混合
接种：根把病毒秘美接种方法(见表3)。4.2.4.3
鸡胚，
藤释度，姆
叫见表2.#
检测普通鸡血
撼作时间/n
30或60
解,每救薄还接种 0. 2 ml.
臀度种4枚鸡胚，每枚鸡怀接
病毒接种胚龄与方法
病毒种类
含脑脊盐炎病斑
传染性支气管瓷病带
传染性然氏囊病病毒
传染性喉气管炎病毒
注： $-
4.2.5孵化
卵黄类;CAS-尿胆ICAM
绒泪尿囊膜（接冲芳法参见附录B)接种方法
将接种后的鸡胚放入孵化器，继续孵化。根鹅病毒不同，选定不同的孵化时间（见表4），2
合品伙伴网httn：
离脏脊炎病毒
传染性支气管炎病毒
传染性然氏密病病毒
传染性喉气炎病毒
4.2.6观察和记录
接种鸡胚的孵化时间
GB/T17999.3--2008
孵化时间/d
每且期胚，记录各红鸡胚的死产数24h内死亡的鸡胚葱曦不计)；孵化期满，记录各组鸡胚的感梁数（参照附录C中的描述逊行）
4.2.7计算中和指数
4.2.7.1统计原理
结果以中和指数表
应计算山病毒对照和
示例。
示例：
癌毒对照组影
病稀释度
新指数表示被检血清中有无中和抗夜中和病暴的能力。为求中和指数，精/病香
精/病避试
往：分母表示接和露
病稀释度
死心比例
中和指数计算
病毒对照组
子装肉病毒感染死
压数（表6同）
为中和擦数（Red和Muench法），参见计
亡比削
表6血清/病毒组死亡愤况
死亡比例
死广百分率/5
死亡百分率/岁
被检血清的中和指数为病毒对照组EIDs效价与而清/病毒组ELD效价的差值ELDG效价为高于50%死亡的病毒稀释度倒数的对数与距离比之和，其中距离比按式(1)计算。品伙伴网httn：
rww.foodmate.net
GB/T 17999. 3--2008
高于50%的死：百分数一50%
距离比=高于50%葡死巴咨务数一很李50%的死亡百分数示例：
表5中，病毒对照组ELDs：效价在10-？~10\之间，则：病毒组对照维 FLD,效价=7十
71. 4—50
7--0.75.--7.75
71, 442.8
表6中，血消/病藓组FL.D效价在10-~10-之间，则：83.3--30
血清/病毒组对照组ELD%效价=7+83.3—40
被检Ⅲ清的中和指数=7.75-7.76-.0.015
结果判定
被检逝清的中和指数轻2.0为附性4
http：/wwW.bzxz.Net
7+0. 76--7. 76
mrfondm
（规范性录）
试剂的配制
胰蛋白陈磷酸盐肉汤（tryptonephosphatehroth）4
胰蛋白陈
葡萄糖
氯化钠(NaCi）
磷酸氢二钠(Na.HPO.)
GB/T17999.3--2008
加1L双蒸水，完全溶解后分装，121℃灭菌15tmin，4.℃保存备用，可放置6个月：A:2声霉素/链磐素（双抗)液
青薇素
100 000 U
加双蒸水至10nL，经无菌0.22um滤器过滤除菌后，一20℃保存备用，可放置12个月：http：
ww.foodmate.net
GB/T17999.3—2008
B.1卵黄囊(YS)接种
附录B
（资料性附录）
病毒接种技术
选5日龄·~7日龄鸡胚经照蛋检查后，润出气室和胎位,对应气室中央的蛋壳先用2.5%礁酒消毒，再用75%酒精脱碘，用打孔器打一小孔，勿损伤壳膜。接种时饣买迅速稳定地通过小孔，潜胚的纵卵深入约3cm，此时注射器轻轻往回抽·下，如针头在兜黄葬中，可见卵黄被抽出，此时就可将注射物注人，用融化的衔蜡闭荒孔，置37培养，B.2尿囊腔(CAS)接种
选口龄~11目龄鸡胚,照检后画山气窄边界,在气窄交界边缘以上约1mm处并避并血誉作标记,此为注射点。在点周围先用2.5%斌酒消毒，再用75%酒精脱瓣。用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤觉膜。用注射器注入样品0.2mL，然后用融化的行惜过口，置37℃培养，B,3绒毛尿囊膜(CAM)接种
选101龄鸡胚，在还胎附近略近气案处，选择血管较少的部位，用记号笔在卵壳上标记出个直径约3mm~41mm的圈，用2.5%碘酒消书，再用75%酒精脱碘，小心用刀尖将圈内的卵壳撬起，造成卵窗，似不可损伤壳膜。在气室端出钻一个小孔。随后用针尖轻轻挑被卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿膜，滴加1滴灭菌生理盐水于刺被处：用像皮乳头紧贴于气案中央小孔上吸气，造成气案内负压，使卵窗部位的绒毛尿题膜下陷仙形成人工气室，此时巧见滴加于膜上的生理盐水迅速渗人。用14 号针头嚣滴入2 滴--3 滴接种物干绒毛尿整膜上。最后用透明胶纸封征卵窗,周围涂以融化的石蜡密封之。气室中央的小孔可用石蜡密对住。鸡胚在接神后，横断于孵卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。紫37C培养：
C.1·离脑脊髓炎病毒所致的特异病变附录℃
(资料性附累)
鸡胚病变特征
GB/T17999.3—2008
早期为胸腰部肌肉皮下水肿，当接种后10d～12d，解活胚时，见躯肌萎缩、足耻着曲。如出现此类特征，判为感染。
C. 2传染性支气管炎病毒所致的特异病变鸡登曲、矮小，脚变形床在头上，羊膜增厚、卵黄囊收缩，易破裂。如出现此淡特征，判为感染。C.3传染性喉气炎病毒所致的特异病变感染传染性喉气管炎病毒的鸡胚，可在绒毛尿变膜上形成症斑。如出现粒斑，判为感染C4
传染性法氏囊病毒所致的特异病变鸡胚充血，在羽毛囊、趾关节和脑有血斑性出前，肝脏多可见坏死，可见灰压肝体似熟肉样。如出现此类特征，判为感染。
GB/T17999.3—2008
参考文献
『1GB/T191672003传染性攀病诊断技术[2]NY/T$6—2002鸡传染性曦气管炭诊断技术httn：
//mrfoodmatono
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。