【国家标准(GB)】 饲料中维生素E的测定 高效液相色谱法

ICS 65. 120
中华人民共利和国国家标准
GB/T17812--2008
代替CB/T17812-1999
饲料中维生素E的测定
高效液相色谱法
Determination of vilamin E in feeds-High-pcrformance liquid chromatography2008-12-31发布
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中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准代替GB/T178121899《饲料中维生素E的测定高效液色灣法》。
本标准与GB/T17812—-1999相比主要变化如下：一原标推方法为第一法皂化提取法（仲裁法）；GR/T17812—2008
一补充第二法直接提取法（快速法），适用于维生素预混料中维生素E的测定。本标准出全国饲料L业标推化技术委员会（SAC/TC 76)提出并归口。本标准起节单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、国家饲料质量监督检验中心（北京），北京桑普生物化学技术有限公司，广东爱保农科技有限公司，帝斯曼维生素（上海）有限公司。本标主要起草人：赵小阳、随文娟、虞哲高、吴革华、李俊玲、李永才、张进。本标准所代替标准哟历次版本发布情况步：-GB/T17812-1951。
一范围
饲料中维生素E的测定
高效液相色谱法
本标谁规定了饲料中维生素E的测定一一高效液相色谱法。GB/T 17812—2008
本标准第一法适用于配个饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素E（-生育）的测定，定量限为1mg/kg。本标准第二法适用于维生素预混合饲料巾维生素E(αl-a-生育酚乙,酸酯)的测定，定量限为20mg/kg
？规范性引用文件
下文件中的条款通过本标准的引用而成为本标难的条款。凡是注日期的引用义件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注日期的引用文件，其最新廠本适用于本标谁，GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603·-2002，JSO6353-1：1982，NEQ
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，1S(）36961987MOD）GB/T14699.1饲料采样(GB/T14609.12G05,IS06497.2002,IDT)GB/120195动物伺料试样的制备（GB/T20192006,JSO6498：1998,IDT）3第一法皂化提取法（仲裁法）
3.1原理
用碱溶渺皂化试验样品，使试样天然上育酚释放出文，添如的l-a-丘育酚乙酸酯转化为游离的dl-α-生育酚，乙翻提取，蒸发乙醚，用正已烧溶解残渣。试液注人高效被相色谱柱·用紫外检测器在280 nm处测定，外标法计算维生素E(dl-α生育酚)含量。3.2试剂和溶液
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中一级用水规定，色谱用水符合GB/T6682中一级用水规定.溶液按照GB/T603配制。3.2. 1碘化钾溶液:100 g/L.,
3.2.2淀粉指示液：5 9/1.。
3.2.3硫代硫酸钠溶液：50g/1.。3.2.4无水乙酵：不含过氙化物。3.2.4.1过氧化物检查方法:用mLZ,醚加 1 ml.碘化钾溶液(3.2. 1),振摇1 min,如有氢化物则放游离碘，水层旱黄色，或加淀粉指示液（3.2.2），水层呈谥色，该乙醚需处理后使用。3.2.4.2云除过氧化物的方法：乙醛用硫代硫酸钠溶液（3.2.3)振摇，静置，分段7醚层，再用蒸瘤水振摇，洗涤两次，重蒸，弃去首尾！%部分，收集馏出的乙避，再检查过氧化物，应符合规定。3.2.5片水乙醇，
3.2.6正己烷：色谱绝。
GB/T 17812—2008
3. 2. 7 1,4 二氧六环。
3.2.8甲醇：色谱纯，
3.2.92,6-二叔」基对甲酚(BHT)。3.2.10无水硫酸钠，
3.2.11氢氧化钾溶液：5009/门.。3. 2. 121-抗坏血酸乙醇溶液:5 g/1-。取 0. 5 g L-抗坏血酸结品纯品溶解于 4 mL温热的蒸馏水中,用无水乙醇(3.2.5)稀释至100 ml.,临用前配制。3.2.13维生素E(dl-α-生育酚）对照品：dl-u生育龄合量≥99.0%3.2.14dl-α-生育酚标准贮备液：称取dl-α-生育酚对照品（3.2.13)100mg（精确至0.00001g）于100 mL棕色容量瓶中，用正已烧窃解并稀释至刻度-混寸4℃保存。该忙备液浓度为1.0 rg/mL，3.2.15d a生育酚标雅工
准确吸取dlα牛育酚标摊贮备液（3.214），用正凹烷（3.2.6)按1：20比例稀释，芳用反相色骨测定，将1.0mldlu牛育酚标准贮备液置人101L棕色窄量税巾，用需等至刻度，混勾，再按比例稀释，配制工作液浓度为50μg/ml.。氮气吹干,用甲醇(3.2.
3.2.16酚酷指示剂乙醇
清液：10年
氮气(纯度
3.3仪器和设备
分析天平
感量分别为0.0001名
可底烧瓶流冷凝器。
3.3.3恒温水浴
3.3.4旋转蒸发
3.3.5超纯水器
3.3.6高效液相色语仪，带紫外调波长检测器（或二极管短阵检测器）。3.4来样
按照GB/T 14
3.5试样制备
的规定执行
都试样，磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混匀，装人需闭容器中，避光低温保存按照GB/T 20195
备用。
3.6分析步
3.6.1试样溶液的制备
3.6.1.1皂化
称取试样配合饲料或浓缩饲料 10 g,精确至0,001 g,维生素预混料或复合预混料 1 g~~5 g,精确至0.0001g：置人250mL圆底烧瓶中，加50mLL-抗坏血酸乙醇溶液（3.2.12）,使试样完全分散、浸碰，置于水浴上热直到沸点,用氮气吹洗稍冷，加10mL氢氧化钾溶液（3.2.11)，混合均勺，在氮气流下沸腾皂化目流30mir.，不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化绪束，分别用5ml水乙醇（3.2.5）、5 ml 水自冷凝管顶端冲洗其内部,取出烧瓶冷却至约 40 ℃ 。3.6. 1.2提取
定量的转移全部皂化液于盛有1001L无水乙醛（3.2.4)的500mL分液漏斗巾，用30ml.50)mL蒸馏水分2次3次冲洗圆底烧瓶并人分液漏科斗，旭盖，激气，随后混合激烈振荡2min，静置、分层，转移水相丁篇二个分漏斗中，分次用1U mIG0 ml.乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相，用蒸馏水每次100mL洗涤之醛提取液至中性，初次水洗时轻轻凝摇，防止化。之醛提取液適过无水2
GB/T 17812—2008
硫酸钠（3.2.1C)脱水,转移到250 πL棕色容量瓶中.加100 mgBHT(3.2.9)使之溶解，用乙醚定容至刻度(V）
3.6.1.3涨缩
以乙醚提取液(V,)中分取一定体积(V)(做据样品标示量、称烊利提取液量确定分取量)置于施转蒸发器烧瓶巾，在部分真空、水浴温度约50C的条件下蒸发至干或用氮气吹干。线渣用止已烷溶解（反相色谱用甲醇落解），并稀释至10rL(V.)使获得的溶液巾每毫升含维生素E(dt-a-牛育酸）50μg100g，离心或通过0.45uT过滤膜过滤，用于高效液相色谱仪分析。3.6.2测定
3.6.2.1色谱条件
3.6,2. 1.1正相色谱
orbP60.长125mm，内径4. 6mm，粒度5um,色谱柱：硅胶Lichro
入环=97十3；
流动相:正已烷十
流速:1.0 mL/1
湿度：室温；
近样量：201
检测器：紫先
波长检测器（或二极背知阵检测器）检测波长280nm反相色谱
3. 6. 2. 1. 2
色谱柱：C
流动相：#
长125mm.内径
mom粒度
水-95+5
流速：1.0
混度：室温
违样量：20
检测器：紫波长检测器（或二极管矩阵检测器），检测波长 280 m。3. 6.2.2定量测
按高效液相仓鲁双说明书调整仪器操作参数向色谐柱注人相应的维生素dl-α-生育酚）标准工作液（3.2.15）和试祥合夜（3.6.）3.6.2.3结果计算
3，得到免谱峰面积响应值，用外标法定量测定。3.6.2.3.1试样中维车全
的含量（X,）以质量分数［国际单位（或毫克）每千克(lU或mg/g)表Is
示,按式(1)计算。
式巾：
试样溶液（3.6.1.3)降面积值：P,xV,xVxe
提取液（3.6.1.2)的总体积，单位为毫升（1uL）；Vi
V3试样游液（3.6.1.3)最终体积,单位为毫升（mI);标准工作液(3.2.15)浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）：P.
-标准工作液（3.2.15)峰面积值：抗样质量单位为克（包)；
从提取液(V,)中分取的济液体积，单位为毫升（mI）(1)
转换系数,l 1u维素E相乌于 0. 909 mg dl-a-生育酚-或 1. 0 mg dl-α-生育酚z酸酯。半行测定结果用算术半均值表示，保留三位有效数字。3. 6.2. 3. 2
GB/T 17812—2008
3.6.2.3.3重复性：同一-分析者对同一试样同时两饮平行测定所得结果的相对偏差见表1。表1
dl-a-作育酚含量/
(nig/kg)
4篇二法
4.1原理
直接提取法（快速测定法）
相对遍差/
维生素预混料中的维生素E(ll-α-生育酚乙酸酪）用甲醇溶液提取，试液注入高效液相色谱柱，用紫外检测器（或二极管矩阵检测器）在2851m处测定，外标法计算维生素E(dl-α-生育酚乙酸醋）含量。4.2试剂和溶液
除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水符合GB/16682中.级用水规定，色谱用水符合GB/T6682中-级用水规定
4. 2.1维生素E(dt-α 尘育酸艺酸酯)对照品r:dl-α.生育酚乙酸酯含量99.0%。4.2.2维生素E（dl-a生育酚乙酸酯）标准赔备液：称取dl-α-生育酚乙酸酯（4.2.1)l00mg（精确至0.00001g)，于1C0mL.棕色穿量瓶中，用中醇(3.2.8)溶解并稀释至刻度，混勺,4℃保存。该贮备液浓度为1.0mg/rL
4.2.3维生素E（dtx-生育酚乙酸酯）标准工作液：推确吸取d2-α-生育酸乙酸酯标准贮备液（4.2.2)1.0ml.丁10ml.棕色容量瓶中，用甲醇（3.2.8)稀释至刻度，混，配制工作液浓度为100μg/ml。4.3仪器和设备Www.bzxZ.net
4.3.1超声波水浴,
4.3.2其他同3.3。
4.4采样
同 3. 4,
4.5试样制备
同3.5。
4.6分析步骤
4.6.1试样溶液的制备
称取试样 1 g,精确至 0,000 1 g,置于 100 ml. 的棕色容壁瓶疯中,加人约 80 ml. 的甲醇,瓶塞不要紧，于60超声波水浴中超声提段30min，冷却至室温，用甲醇稀释至刻度，充分勺，如果试样中维生素E(dl-α生育酚乙酸酯）的标示最低于10g/kg，则将溶液过0.45um滤膜，进样测定，否则需将溶液用甲醇进一步稀释，使维生素E(dlu-生育酚乙酸酯）的进样浓度在10Hg/ml.~120g/ml.之间。4.6.2测定
4.6.2.1色谱条件
色谱柱：Cl,型柱，长15g mum，内径4.6 mrm，粒度5μm:流动：甲醇水--98-12；
流迷：l.0n/nin;
温度：宰温：
进样量：20μl;
检测器：紧外可调波长检测器（或二极管矩陪检测器）检测波长28!:n:m。4. 6.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数，向色谱杜注人相应的维生素E(dlα-生育乙鞍醋）4
GB/T 17812—2008
标准工作液（4.2.3)和试样溶液（1.6.1),得到色谱峰面积响应值，用外标法定量测定。4.6.2.3结果计算
4.6.2.3.1试样中维生素E的含量（X，），以质量分数［国际单位（或毫克）每于克（IU或11g/kg）表示，按式(2)计算。
PXmz× f2
式中：
试样溶液（4.6.1)峰面积值：
-试样溶液（4.6.1)的总稀释体积，单位为升（mL）；V
标准.L作液（4.2.3)淤度，单位为微克每亳升(pg/mL)；-标准工作液（4.2.3)峰面积值；P
试样质量，单位为克（g）；
--（2)
转换系数，1IU维生素E相当于0.909mgdl-α-生育酚，或1.0mgdt-α-生育酚乙酸酯。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数疗。4. 6.2. 3. 2
4. 6. 2. 3. 3
重复性：同一分析者对同-试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于10%5
GB/T 17812-2008
打H期，200年上34日
中华人民共和园
国家标推
饲料中维生素F的测定
高效液相色谱法
CB/T 17812--2008
中国标理出版社出版发行
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2C09年4月第次印刷
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