【国家标准(GB)】 SPF鸡 微生物学监测 第2部分：SPF鸡 红细胞凝集抑制试验

1CS 11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T 17999,2—2008
代誉GH/T17999.1—1999
SPF鸡
微生物学监测
第2部分：SPF鸡：红细胞凝集抑制试验SPF chickcn--Microbiological surveillance-Part 2: Hemagglutination inhibition test for SPF chicken2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
GB/T 17999SPF鸡
微生物学监测》分为10个部分，第1部分,SPF鸡
第2部分:SPF鸡
第 3 部分:SPF 鸡
第 4部分:SPF 鸡
第 5 部分:SPF鸡
第6部分：SP 鸡
第7部分:SPF鸡
第8部分:SPF鸡
第 9 部分:SPF 鸡
微生物学监测总则；
红纫胞凝集抑制试验；
耻清中和试验;
血清平板集试验：
琼脂扩散试验；
联免疫吸附试验
胚徽感试验；
鸡白痫沙门氏菌捡验；
试管凝集试验：
第10部分：SPF鸡
叫接免疫荧光试验：
本部分为GB/17999的第2部分。
GB/T 17999, 2---2008
：本部分修订参服了GB/T18936—2003高致病性食流感诊断技术》、SN/T1109—2002新城疫微：量红细胞凝集抑制
试验操作规程、SN/T1182.2一200A《离流感微量红细胞凝集抑制试验》NY/T551-2002《产蛋下降综合征诊断技术》.0IE际生动物（哺乳动物、食乌和密峰）诊断试验和疫苗手册》(第五版)中的有关规定。本部分代替G3/T17999.1-1999≤SPF鸡红细胞颜集抑制试验》.本部分与GB/T17999，7-1999相比主要变化如下：增加了规范性附录A“试剂的配制”和资料性附录B1%鸡红细胞悬液的制备”增加了对V形孔微量血凝板进行试验的结果判定：对禽流感病毒、新城疫病、传染性艾气管炎病毒、禽腺病毒ⅡⅢ群（EIS)鸡毒支原体和滑液囊支原血疑抑制抗体的判定标准进行了修改。.本部分的附录A为规范性附录,附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由余国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口，本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法斯家禽有限公司。
本部分主要起草人：曲连东、刘家森、韩凌殷、邵卫呈、笨果、单忠芳、姜攀、司昌德、于海波、孟庆文。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T 17999.1—1999,

.SPE鸡·微生物学监测
GB/T 17999.2—2008
第2部分,SPF鸡
鸟红细胞凝集抑制试验
.GB/T17999的本部分规定「红细胞凝集抑制试验的技术要求本部分适用严对SPF鸡进行以下病原微牛物的血凝抑制抗体检测：含流感病毒（AvianInflienzaVirus)，传染性支气管炎病萨（Infectiaus Bronchitis Virus）新城疫病毒（Newcastle Diseasc Virus)，商腺病净且群《减蛋综合征病奇）（AvianAdenovirusGroupmr），鸡毒支原体（Mycaplusmagaltisepticum）,游液囊支原体(Mycoplasmasynoriae)2原理
许多病原微生物具有凝集动物红细胞的能力，这种凝集红细胞的能力能被特异性抗体所抑制，因此可用已知病原微生物检测相应的血凝抑性抗体。试剂和器材
3.1试剂
3. 1. 1 血凝抗原。
3.1.2阴性、阳性血滤，
3.1.3：被检血清。
3.7.4鸡红细胞。
3.1.5：0.85%氯化钠（NaCD（见附录A），3.1.6：阿氏液（见附录A）
3.2器材
3.2.1：96孔微量血凝（U形孔或V形乳）3.2.2微量移液器（量释为25:50μ、100μl)或可调微量移液器（量程涵盖25L、50100μ）及吸头。
3.2.3水浴锅。
3.2.4离心机与刻度离心管
操作程序
4.1红细胞悬液的制备和抗原血凝效价测定4.1.11%鸡红细胞悬液的制备
参见附录1.
.4. 1.2抗原血凝效价测定
4.1.2.1，于96孔微盘血凝板的第1孔一第12孔加人生理盐水25，共作2排。每排的第1孔加人抗原25L，而微量移液器，从第1孔一第11孔对抗原作系列倍比稀释：即将第1孔的抗原与生理盐水用移液器反复吹吸3次后，吸出25mL移至第2孔，再反复欧吸3次后，吸出25μL移至第3孔，依此类推，直至第11孔。从第11孔中吸出25μL弃去，此孔抗原的最然稀释度为-1：21（即11kg）。第12孔作为对孔。
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4.1.2.2每孔中期入25生理盐水，再加入1%鸡红细胞悬液25，4.1.2.3将血凝板骨振荡器上500r/min振菌1min~2min4. 1.2. 4在室温 18 ~25℃下箭置 20 min～40 nin,或 37 ℃静置 15 min-~20 min+或 4 C静置60 min..
4.1.2.5抗原鹿凝效价判定：在反应时间内，对照孔的红缅胞全部沉淀时，观察判读血凝结果。对于使用形乳微量也凝板进行的试验，可根据表1中列举的标准进行判读。表1血凝试验结果判读标准
红纵胞全部凝集勾于孔底，即10%红细炮染红细咆凝牵本同类梨必乳底有大圆红细胞酶
红维能
极中等大的圈，四周有小凝块
底形成小圆点，四周有少许凝集块抗底星
年家100%
注：能使红细施完
位。注蔗对确
翼完全不
对于使用√邢孔微量加读极进
面向下是线状流或食数灿现全部为1个血凝单位！
若而凝效价高鼠乳
loga 时,可
喔见表2。
凝试验学康
滴度（loa）
生理盐水?!L
倍比希释的抗原/I
生理盐水/ml
1%鸿红细胞/起
作用温度、时间
判定学候
殖凝价判定为910g2。
将血凝板佩
撒胞无流
激抗膚
帮释孔数，逛行置
4.2血清的处理和血凝抑制试验
4.2.1被检血清样品准备
不凝集
原的府露效价，效价为1个而凝单沉淀于乳的缝细胞是香沿倾斜
度为该抗款的真凝效价，该效价测定
18℃~-25 ℃静2-10
被检清，包括阳性阴性血清，置于56C水浴中30min-45min，以破坏补体及血溅抑制因于，4.2.2抗原准备
进行血凝抑制试验时各种抗原所用而避单位为4个血凝单位以4个血凝单位抗原的配制为例：如果某抗原的血凝效价为910%：，配制4个血凝单位则进行1：2稀释（2°/2*一2°），取牛理盐水11.8mL，加入1：1C稀释的抗原1.0mL，混合均匀即可。4.2.3抗原血凝效价的重测定
4.2.3.1为了确证而凝抑制试验时使用抗原的活性，有必要对已配制的4个血凝单位抗原进行血凝效2
http:
uwrfoo
价的再测定，此项试验常与血凝抑制试验同时进行。第1孔分别加人50μL4个血凝单位抗原。4. 2. 3. 2
4. 2. 3. 4
4.2. 3. 5
4. 2. 3. 6
4. 2. 3. 7
第2孔~第1孔各加生理盐水25L。将抗原分别作系列倍比稀释至第4孔，从第4孔吸25μ弃去，每孔加1%鸡红细胞悬液25μL
将血凝板置微量振落器上以500t/min振荡1'min~2min。案温18℃=22℃感作20min～40mi充右GB/T 17999.2--2008
观察结果，4、2、1血凝单位孔红無胞出现完金凝集，0.5血凝单位孔红细胞出现50%凝策。4.2.3. 8
若不相衍，则应重新标定抗原的血凝率位，同时进行的血凝抑舒试验也需重新进行。4.2.4
血凝抑制试验
4. 2. 4. 1
血凝板称排检测
4.2.4.2第1孔～第
被检妞清，设阳性血清与阴清对期。乳媚人25μ生理盐水。
4.2.4.3吸取血清2第1孔中，混勾后吸取251.加人第孔中，此类推倍比稀释到第11孔，弃去25μ，第
纳空白
4.2.4.4第1孔
振荡1 min～2
4. 2. 4. 5
22静置20wwW.bzxz.Net
4.2.4.6.静置
使用V形微垦
动。呈现与红
被检血清血凝
滴度（lota）
生埋盐水/5
倍比释的被检血清，
4 个血凝单位抗原/μL
很月湖度，时间
1%鸡红细/uL
作用温度,时间
刊定举例
孔分是
鸡红细
lomin或
对于使用！
逊行的试
照孔（第12
价。血凝把
以500
nin,此时对店
美者为完全不凝集王
被检血清血避抑制价为1：32(25）5‘结果判定
25℃静片
缸凝板微量家荡器上以5001/minmin～~2 in 混勺,置室温(18 ℃ -孔)的红细胞己忆淀为一个圆点：表1中列的树进行判读。对可
底的红细胞帮倾臀面向下呈线状流完企不凝集的垂情故高稀释度为该定例
so min
5.1检套备种对照。阴性血消血凝抑制滴度应1.：4（2），阳性血面凝抑制滴度与已知滴度不应相差·个滴度以上，红细胞对照无血凝现象：5.2食流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽腺病毒目群（EIS)的血清血凝抑制效价1：16（2+)判为阳性；鸡幸原体、清凝攀支原体的血清血凝抑制效价三1：64（25)判为阳性。3
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A,1阿液(Alsever s)
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
葡荷糖2.05g，氛化钠氯化钠4.25，溶F500ml.蒸馏水.调pH至7.4，1.21%高压灭菌15min，4℃保存备用。食品伙k伴网httn：//foodmate.neB.1 鸡血采集
附录Ｂ
（资料性附景）
1%鸡血红细胞感液的制备
GB/T17999.2-2008
用注射器吸取阿氏液约1mL，坡3周龄～10.用龄SPF鸡（最少两只），从胸骨尖下为约1.3cm处将注射器针头潮人心脏，吸取心血约2mL~4mI与10mJ阿氏液轻轻混合并置于离心中B.2鸡红细胞洗涤
将离心管中的血被经1500r/min~1800r/min离心8min，弃.上清液和沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再次加入阿氏液，冉重复以上过程后，加入阿氏液20，重悬沉淀，轻轻混合成红细胞悬液。B. 3
红细胞体积（压积）
推确计算保存在阿氏液中的鸡红细胞湛液体积（V,），经1500r/min--1800r/mii离心8min，吸取上清被，计算其体积(V)，计算红细胞体积V（V。=V一V)，B.41%鸡红细胞总液
1倍体积（mL）的红细胸，加人99倍体积（mL）的生理盘水：用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞均勾混合。
GB/T17999.2—2008
参考文
[1]GB/T189362003
高致病性离流感诊断技术
NY/T551—2002产蛋下降综合征诊断技术[3]
SN/T1109—2002新城疫微红细胞凝集抑制试验操作规理
SN/T 1182.2-200M
禽流感微量红细胞凝集抑制试验6
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