【国家标准(GB)】 水产品中河豚毒素的测定 液相色谱-荧光检测法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T23217-—-2008
水产品中河豚毒素的测定
液相色谱-荧光检测法
Determination of tetrodotoxin in aquatic products-HPLC-fluorescence detectionmethod2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
华人民共和
国家标准
水产品中河豚毒素的测定
液相色谱-荧光检测法
GB/T23217-2008
中国标准出版社出版发行
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
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电话：6852394668517548
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开本880×12301/16
2009年4月第一版
印张0.75
字数15千字
2009年4月第一次印刷
书号：155066·1-36697
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本标准的附录A、附录B、附录C为资料性附录。言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T 23217—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：杨方、钱疆、刘正才、林中、张云、林永辉、陈健、庞国芳。1
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水产品中河豚毒素的测定
液相色谱-荧光检测法
GB/T23217—2008
本标准规定了水产品中河豚毒素测定的液相色谱测定方法与液相色谱-申联质谱确证方法。本标准适用于河豚鱼、织纹螺、虾、牡蛎、花蛤、鱿鱼中河豚毒素的测定与确证。本标准方法的检出限为0.05mg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1—2004,ISO5725-1：1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
试样中含有的河豚毒素采用酸性甲醇提取，提取液浓缩后，过C1固相萃取小柱净化，液相色谱-柱后衍生荧光法测定，液相色谱-串联质谱法确证，外标法定量。4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1甲醇：色谱纯。
4.2乙酸：色谱纯。
4.3甲酸：色谱纯。
4.4乙酸铵。
4.5氢氧化钠。
4.6庚烷磺酸钠。
4.71%乙酸甲醇溶液：移取10mL乙酸，以甲醇稀释至1L。4.81%乙酸溶液：移取10mL乙酸，以水稀释至1L。4.9乙酸铵缓冲液：称取4.6g乙酸铵和2.02g庚烷磺酸钠，加人约700mL水溶解，以乙酸调节pH值为5.0,以水稀释至1L。
4.100.1%甲酸水溶液：移取1mL甲酸，加水稀释至1L。4.114mol/L氢氧化钠溶液：称取160g氢氧化钠，以水溶解并稀释至1L。4.12河豚毒素标准物质（tetrodotoxin，分子式CnHi>N.OsCAS4368-28-9）：纯度≥98%4.13标准贮备液（100mg/L）：准确称取河豚毒素10.0mg，用少量水溶解后以甲醇定容至100mL，该标准贮备液置于4℃冰箱中保存。1
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4.14标准工作液：根据需要取适量标准贮备液，以0.1%甲酸水溶液十甲醇（9+1，体积比）稀释成适当浓度的标准工作液。标准工作液当天现配。4.15基质标准工作液：以空白基质溶液配制适当浓度的标准工作液。基质标准工作液要当天配制。4.16C1s固相萃取柱，500mg/3mL，用前依次以3mL甲醇，3mL1%乙酸溶液（4.8）活化，保持柱体湿润。
4.17滤膜0.2μm。
3离心超滤管，截留相对分子质量为3000，1mL。5仪器
5.1液相色谱仪，带有荧光检测器与柱后衍生装置。5.2液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。5.3分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.4组织揭碎机。
5.5旋涡振荡器。wwW.bzxz.Net
5.6超声波发生器。
5.7减压浓缩装置。
5.8固相萃取装置。
5.9真空泵：真空度应达到80kPa。5.10微量注射器：1mL~5mL,100μL~1000μL。5.11离心机：转速达4000r/min。5.12
离心机：转速达13000r/min，配有酶标转子。5.13冷冻高速离心机：转速达到18000r/min，可致冷4℃。5.14K-D浓缩瓶：100mL与25mL。6试样的制备与保存
制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。由于河豚毒素为剧毒物质，对于可能含有河豚毒素的产品，应避免直接接触或误食，相关的器皿和器具可以采用4%碳酸钠溶液浸泡加热去毒处理。
6.1试样制备
从所取全部样品中取出有代表性样品的可食部分约500g，切成小块，放人组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记。6.2试样保存
试样于-18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。7测定步骤
7.1提取
称取5.00g匀浆样品置于50mL聚丙烯离心管中，加人20mL1%乙酸甲醇溶液（4.7)，旋涡振荡2min，50℃水浴超声提取20min，4000r/min离心5min，取上清液，在残渣中再加人20mL1%乙酸甲醇溶液，重复以上步骤，合并上清液，过滤至100mLK-D浓缩瓶中，60℃旋转蒸发浓缩至近干，加入2mL1%乙酸溶液（4.8），振荡洗涤浓缩瓶，转移至10mL聚丙烯离心管中，4℃下于18000r/min离心10min，取上清液待净化。
7.2净化
将7.1所得的澄清溶液以约1mL/min的流速过柱，用10mL1%乙酸溶液（4.8)洗脱，合并流出液2
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与洗脱液，置于25mLK-D浓缩瓶中，于60℃下减压浓缩至近干，用1%乙酸溶液（4.8)定容1mL，过0.2um滤膜，供液相色谱分析。进行液相色谱-串联质谱确证时，将样液装入离心超滤管中，13000r/min离心15min，取滤液测定。7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5.00g，按7.1和7.2操作。7.4测定条件
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：PurospherStarPR-18eC柱，5μm，250mmX4.6mm（内径）或相当者；b）柱温：30℃；
流动相：乙腈-乙酸铵缓冲液（4.9)1+19）；c
d）流速：1.0mL/min；
激发波长：385nm，发射波长：505nm；e)
进样量：40.0μL。
7.4.2柱后衍生参考条件
衍生溶液：4mol/L氢氧化钠溶液（4.11)；a)
b）衍生溶液流速：0.5mL/min；c）衍生管温度：110℃。
7.4.3色谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中河豚毒素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱条件下，河豚毒素的参考保留时间为10.3min，根据标准溶液色谱蜂的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并外标法定量。标准品高效液相色谱图参见图A.1。7.5确证
7.5.1液相色谱-串联质谱条件
色谱柱：AtlantisTMHILICSilica）3μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者；a)
b）流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液（4.10)(17+8)；c)
柱温：30℃：
进样量：10pL；
流速：200μL/min；
f离子源：电喷雾源ESI，正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM)；g)
离子源温度：500℃；
雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体；使用前应调节各气体流量i
以使质谱灵敏度达到检测要求；仪器工作所需电压值应优化至最优灵敏度；1
k）定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量见表1。表1定性离子对、定量离子对、碰撞池出口电压和碰撞气能量化合物中文名称化合物英文名称定性离子对（m/）定量离子对（m/z）碰撞气能/V碰撞池出口电压/V
河豚毒素
tetrodotoxin
320/302
320/162
320/162
1）AtlantisTMHILICSilica色谱柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
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7.5.2液相色谱-串联质谱确证
将基质标准工作液和7.2中所得滤液（必要时用乙睛稀释至适当浓度）用LC-MS/MS测定。如果样液中与标准工作液相同的保留时间有检测离子峰出现，则对其进行质谱确证。河豚毒素标准溶液的液相色谱-串联质谱图参见图B.1。7.5.3定性标准
7.5.3.1保留时间
待测样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在士2.5%之内。7.5.3.2信噪比
待测化合物的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3(S/N≥3）。7.5.3.3定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表2规定的范围。
相对离子丰度K
允许的相对偏差
7.6平行试验
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差K>50
20按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。10K≤10
7.7回收率试验
在阴性样品中添加适量标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。河豚毒素的添加浓度及其回收率范围的试验数据参见表C.1。8结果计算
用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按式（1)计算试样中河豚毒素含量：X=(c-c)xV
.（1)
式中：
X—-试样中河豚毒素含量的数值，单位为微克每千克（μg/kg)；c一由标准曲线而得的样液中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升（μg/L)；co—-由标准曲线而得的空白实验中河豚毒素含量的数值，单位为微克每升（μug/L)；V—样品最终定容体积，单位为毫升（mL)；m—最终样液代表的试样量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算的。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限（r），被测物的添加浓度范围及重复性方程见表3。
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化合物名称
河豚毒素
河豚毒素的添加浓度范围及重复性和再现性方程表3
添加浓度范围
样品基质
河豚鱼
织纹螺
注：m为两次测定结果的算术平均值。重复性限
lgr=0.8006lgm-0.2689
lgra0.8667lgm-0.2338
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单位为毫克每千克
再现性限R
lgR=0.9471lgm-0.4329
IgR=0.9826lgm-0.6673
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限（R），被测物的添加浓度范围及再现性方程见表3。
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附录A
（资料性附录）
标准物质液相色谱图
河豚毒素标准物质液相色谱图见图A.1。mAU
河豚毒素
1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00t/min
图A.1河豚毒素标准物质液相色谱图http：//foodmate.net附录B
（资料性附录）
标准物质多反应监测（MRM)色谱图河豚毒素标准物质多反应监测（MRM)色谱图见图B.1。1000
m/z320>302
m/=320>162
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1河豚毒素标准品的多反应监测（MRM)色谱图图B.1
http：//foodmate.netGB/T23217—2008
附录C
（资料性附录）
回收率
河豚毒素的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表C.1。表c.1
添加浓度/
(mg/kg)
GB/T23217-2008
河豚毒素的添加浓度及其平均回收率的试验数据平均回收率/%
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河豚鱼
oodmatene
织纹螺
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书号：155066·1-36697
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