【国家标准(GB)】 贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定 液相色谱-荧光检测法

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T23215—2008
贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法
Determination of paralytic shellfish poison in shellfish-HPLC-fluorescence detection method2008-12-31发布
数码防伪
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T23215—2008
本标准负责起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：欧阳姗、谢丽琪、朱玉兰、岳振峰、沈金灿、陈沛金、宋文斌、庞国芳。I
http：//wwwfoodmat1范围
贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法
本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素的高效液相色谱测定方法。本标准适用于贝类中麻痹性贝类毒索的测定。GB/T23215—2008
本标准的方法检出限：GTX4为16.7μg/kg;GTX1为50.7μg/kg；dcGTX3为4.8μg/kg；B1为31.9μg/kg;dcGTX2为17.3μg/kg;GTX3为6.5μg/kg;GTX2为19.6μg/kg;neoSTX为15.7μg/kgdeSTX为12.5μg/kg；STX为14.5μg/kg；合麻痹性贝类毒素总量（STXeq）为125μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.1-—2004,ISO5725-1:1994,IDT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
试样中的麻痹性贝类毒素用0.1mol/L的盐酸提取，离心后，将上清液过Cis固相萃取柱净化，再经过分子质量10000的分子筛超滤离心管过滤，滤液用高效液相色谱进行分离，经在线柱后衍生反应后，进行荧光检测，外标法定量。
4试剂和材料
除特殊规定外，所用的试剂均为分析纯。4.1水:GB/T6682，-级。
4.2乙：色谱纯。
4.3无水乙酸。
4.4盐酸：36%～38%（质量分数）。4.5庚烷磺酸钠。
4.6磷酸：85%（质量分数）。
4.7二水合高碘酸。
4.8磷酸氢二钾。
4.9氢氧化钾。
4.10氨水。
4.11100mmol/L庚烷磺酸钠溶液：称取20.2g庚烷磺酸钠（4.5），用水溶解定容至1000mL。1
品评区
GB/T23215—2008
500mmol/L磷酸溶液：称取49.0g磷酸（4.6），用水溶解定容至1000mL。4.12
4.13250mmol/L磷酸氢二钾溶液：称取43.5g磷酸氢二钾（4.8），用水溶解定容至1000mL。4.141.0mol/L氢氧化钾溶液：称取56.1g氢氧化钾（4.9），用水溶解定容至1000mL。4.15500mmol/L高碘酸溶液：称取114.0g二水合高碘酸（4.7），用水溶解定容至1000mL。4.161.0mol/L乙酸溶液：称取60.0g无水乙酸（4.3），用水溶解定容至1000mL。4.170.01mol/L乙酸溶液：量取10.0mL1.0mol/L乙酸溶液（4.16），用水稀释定容至1000mL。4.180.1mol/L盐酸溶液：量取9.0mL盐（4.4），用水稀释定容至1000mL。4.19标准溶液：麻痹性贝类毒素GTX1，4,GTX2，3、dcGTX2，3、B1(GTX5）、neoSTXSTX、dcSTX标准溶液，避光保存于一20℃以下。4.20标准储备液：将标准溶液用0.01mol/L乙酸溶液（4.17)稀释成一定浓度的标准储备液，避光保存于一20℃以下。
4.21混合标准溶液：分别准确吸取适量各标准储备液，用0.01mo1/L乙酸溶液（4.17）配成所需浓度的混合标推溶液，现配现用。
4.22流动相A：量取15.0mL100mmol/L庚烷磺酸钠溶液（4.11）、8.5mL500mmol/L磷酸溶液（4.12），用约450mL水稀释，用氨水（4.10）调pH至7.2，用水定容到500mL，过0.45μm滤膜。4.23流动相B：量取20.0mL100mmol/L庚烷磺酸钠溶液（4.11）、45.0mL500mmol/L磷酸溶液（4.12），用约450mL水稀释，用氨水（4.10）调pH至7.2，用水定容到500mL，过0.45μm滤膜。4.24氧化液：量取10.0mL500mmol/L高碘酸（4.15）、100mL250mmol/L磷酸氢二钾溶液（4.13），用约450mL水溶解，用1.0mol/L氢氧化钾溶液（4.14）调pH至9.0，用水定容到500mL4.25中和液：1.0mol/L乙酸溶液（4.16）。4.26Cis固相萃取柱：Sep-PakVacC1s,3mL，或相当著。4.27滤膜：0.45μm。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪，配有荧光检测器，柱后衍生反应装置。5.2离心机，5000r/min。
5.3固相萃取装置。
5.4旋涡振荡器。
5.5恒温水浴锅。
5.6超滤离心管，分子质量10000：MilliporeYM-102\，0.5mL，或相当者。6试样制备与保存
6.1试样制备
从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约500g，充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记。
在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。1）Sep-PakVacCis固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2）MilliporeYM-10超滤离心管是Millipore公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
6.2试样保存
试样置于-18℃以下避光保存。
7测定步骤
GB/T23215—-2008
7.1提取
准确称取5g试样，精确至0.01g，于15mL具塞离心管中，加人10mL0.1mol/L盐酸溶液（4.18），振荡均匀。将离心管置于100℃的沸水浴中，加热5min，冷却后，以5000r/min离心10min。7.2净化
Cls固相萃取柱（4.26)使用前依次用6.0mL甲醇和6.0mL水活化，将7.1离心得到的上清液过柱，收集流出液，用水定容至10mL。取约1mL收集液，于分子质量10000的超滤离心管（5.6）中离心，滤液供液相色谱测定。
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Inertsilc8-3（250mmX4.6mm，5pm），或相当者。色谱柱温度：30℃。
c）流动相：流动相A(4.22)，流动相B(4.23），流动相C：乙睛（4.2)。d)
流动相时间梯度，见表1。
时间/min
流动相A/%
流动相时间梯度
流动相B/%
流动相C/%
流速/(mL/min）
柱后衍生：氧化液（4.24），中和液（4.25），反应温度：50℃，反应液流速梯度见表2。单位为毫升每分钟
表2柱后衍生反应液流速梯度
反应液
氧化液
中和液
f）荧光检测：激发波长330nm，发射波长390nm。进样量：10μL。
色谱测定
根据样液中麻痹性贝类毒素的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液。标准工作液和样液中麻痹性贝类毒素的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，标准物质的液相色谱图参见图A.1。7.3.3空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行。7.3.4平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。全品伙伴网httn：Lwwwfoodmate3
GB/T23215—2008
7.3.5回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，按7.1和7.2操作，测定后计算样品添加的回收率。本标推中10种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据参见表B.1。8结果计算和表述
8.1结果计算
样品中各种麻痹性贝类毒素的含量按式（1)计算。Vy1000
式中：
X-—试样中被测组分残留量，单位为微克每于克（μg/kg）；c—一从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V—样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；-样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。m
计算结果应扣除空白值。
8.2毒性转换
按照国际惯例，STX毒素的毒性因子设为1，其他各种麻痹性毒素按照相对于STX的毒性大小来确定毒性因子（如表3所列）；样品中麻痹性贝类毒素的含量则按照毒性因子，统一转换为STXeq来表示，计算公式见式（2）：
式中：
毒性因子
9精密度
-各种麻痹性贝类毒素的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；毒性因子。
表3各种麻痹性贝类毒素的毒性因子GTX1
9.1一般规定
deGTX2
deGTX3
BI(GTX5)
neoSTX
（2）
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限，元贝和扇贝中10种麻痹性贝类毒素的添加浓度范围及重复性方程见表4。化合物名称
添加浓度范围
表4添加浓度范围及重复性和再现性方程样品基质
重复性限r
lgr=0.8500lgm-0.8188
Igr=0.8539gm-0.9002
Igr=1.130 6 lg m-1. 443
lgr=0.969lgm-1.1867
品k伴网httn：/wuwfoodmate
单位为微克每千克
再现性限R
IgR=0.85911gm-0.6088
IgR=0. 729 3 1gm-0. 506 7
IgR=0.8972lgm-0.7528
IgR-0.719 6 Igm-0.528 6
化合物名称
deGTX3
deGTX2
neoSTx
添加浓度范围
样品基质
注：m为两次测定结果的算术平均值。表4（续）
重复性限，
Igr=1. 154 6 Igm-1. 172 6
Igr=1.392 71gm-1. 725 3
lgr=0.8315lgm-0.6425
gr=0.901 6lgm-0.892 9
Igr=0.9312lgm-0.830 4
Igr0. 886 8 Igm-0. 794 3
lgr=0. 922 lgm-0.796 2
lgr=0.89271gm-0.7661
Igr=0. 912 9 Igm-0. 869
lgr0.8554 lgm-0.802
lgr=0.8441lgm-0.5777
lgr0.6535lgm-0.2342
lgr=0.9042 lgm0.816 3
lgr=0.7435lgm-0.5299
Igr=0. 813 2 lgm-0. 660 9
Igr=0.9079 lgm--0.835 1
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单位为微克每千克
再现性限R
1gR-0.9646gm-0.8163
1gR=0.9323lgm-0.9648
lgR=0.817 4 lgm-0.514 7
IgR=0. 706 8 lgm-0. 472 9
IgR=0.8573lgm-0.6391
lgR=0.726 2 lgm-0.425 3
lgR=0.93361gm-0.7881
IgR=0.8415lgm-0.5554
lgR=1.1636lgm-1.177
IgR=0.688 4 Igm-0. 412 2
lgR=0.8394lgm-0.5405bzxZ.net
lgR=0.702 lgm-0.329 4
IgR=0. 858 5 lgm-0.652 3
IgR=0.7552lgm-0.4355
IgR=0.62111gm—0.310 5
IgR-0.7346lgm-0.4503
如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3再现性
在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，元贝和扇贝中10种麻痹性贝类毒素的添加浓度范围及再现性方程见表4。5
r品伙伴网http：//wwwGB/T23215—2008
附录A
（资料性附录）
标准物质液相色谱图
10种麻痹性贝类毒素标准物质液相色谱图见图A.1。my
-dcGTX3;
—B1;
-dcGTX2
-GTX3;
neoSTX
9——deSTX;
10——STX。
图A.110种麻痹性贝类毒素标准物质液相色谱图http：//foodmate.net50
附录B
（资料性附录）
回收率
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本标准中10种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据见表B.1。10种麻痹性贝类毒素添加浓度及其回收率范围的试验数据表B.1
DeGTX3
DcGTX2
neoSTX
水平/
(μg/kg)
回收率范围/%
水平/
（#g/kg）
回收率范围/%
水平/
(μg/kg)
http://foodmate.net回收率范围/%
水平/
(μg/kg)
回收率范围/%
82.6~82.0-
GB/T23215-2008
打印日期：2009年5月13日
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贝类中多种麻痹性贝类毒素含量的测定液相色谱-荧光检测法
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