【商检行业标准(SN)】 对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1151.6—2004
对虾自斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程
Protocol of dot blot and in situ hybridization for white spot virus2004-11-17发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2005-04-01实施
木标雅的附录A为规范性附录。
本标滩出国家认证认可监督管理委员会提出并H口。SN/T 1151.6—2004
本标准起草单位：中华人民其和国深圳出入境检验检疫局、中华人民其和国肯岛出人境检验检疫局、中国水产科学研究院黄海水产研究所，本标准主要起草人：刘斑、需质文、江育林、杨冰、高隆英、史秀杰、黄健、本标为首次发布的山人境检验检疫行业标雅，1范围
SN/T 1151.6—2004
对虾白斑病毒斑点杂交和原位交检测操作规程本标准规定了对虾白斑痴毒的核峻探针检测技术斑点杂交和原位杂交方法。本标准适用二对虾白斑病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过木准的引用而成为亦标准的条欲。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括断误的内容）或修订版均不用丁本标难，然而，鼓慰根据本标准达成协议的各方研究是否可使这些文作的最新版本。凡是不注几期的引用文件，H最新版本适而丁本标涯G13/T6682—1992分析实验室用水规格利试验方法3试剂和材料
3.1所用水非明，应符个G13/6682—：992中一级水的规格。3.2若非注明，本标准使用确认为分析纯的试剂。3.310IG标记的核骏换针：按照国家发明专利Z1.111335.1（专利权人为中国水产科学研究院黄水产研究所)剂技术提供。
SEMPtris研磨液：按照国家发明专利ZL111336.4（专利权人为中国水产科学研究院黄海水产3.4
研究所）的放术提供。
3.520XSSC.见第A.1章，
3.65XSSC:见第A.2章。
3.72×SSC:见第A,3章。
3.81XSSC:见第 A,4 章。
3. 90. 5XSSC:见第 A. 5 章。
3.1010×13ufferI:见第A.6宣。3. 111×13uffer I :见第A,7章。3. 1213uffc:r II(13locking Buffcr);见第 A,8 章。3.1310%十一烷桌磺酸钠(SIS)：见第A.9章。2× SSC/0,[%SIS,贝第 A, 10 章。3.14
3. 15 0, 1× SSC/0. 1%SDS:见第 A, 1[ 章,3. 16预杂交液;见第 A.12 章。3.1710×13uffer Ⅲ见第A13 章。3. 18X×13uffer 而:见第 A, 12 宣。3.19碱性磷酶标记的DIG抗体：150 U(2ocl）,德国 Hnchringrr Mannhcisri 公品或相当产品：
3.2075rg/ml.氮些四唑溶液：见第A，15章。3.21E0 mg/m1.5-溴-1-氯-3-调哚磷酸-甲苯按盐溶被：见第A.16章。3.22显色液丁：见第A.17章。
3.23vicaonAFA固定：见第A、18章。SN/T I151.6—2004
3.24500pg/mL多聚赖氨酸包被液：见第A.19章。3.2510X TNE,见第 A,20 宣。
3. 261×TNI,见第 A, 21 章。
3.27蛋白酶K原液：见第A.22章。3.28蛋酶K工作液：见第A.23章。3.290.2%中醛：见第A,22章。
杂交缓冲溶：见第A,25章。
20X1enhardt s济液：见第 A,26 章。3.31
25%硫酸葡糖溶液：沈第A.27章
3.3310 mg/mL鲜鱼精LNA溶液：见第 A.28章。3.3410%BufferIV：见第A.29常。3. 351XBuffcr IV:见第 A, 30 。3.3610%聚乙烯醇溶被;见第 A,31章。3.37显影液Ⅱ：见第A.32章。
3.38(.5K碑期衰棕-Y落液：见第A.33章：3.39核酸探针斑点杂交阳性对照为已知受WSV 感柒、组织病理学「.有明显WSV病烂H核酸探针斑点杂交恰测呈明显[唑结果的对坏样品纠织研磨1清液（一20℃）。3.40核酸深斑点杂交阴性对照为巨知未受WSV感染Ⅱ核酸深斑点杂交检测里明显阴性结果的对虾样品组织饼磨上清液（20℃），3. 41核酸探针原位杂交阳性对照为受WSV感染且组织病学二有明显WSV病灶的对虾样品。3.42核酸探斗原位杂交阴性对照为未受WSV感染的对虾样品4仪器和设备
4.1普通冰箱：具冷藏箱。
台武离心机:用士「. 5 :,翊将微量离心管的离心,最高转速可达12 00t/rmit以「4.3振荡器：振荡率401/min~-220 1/1-in4. 4 混度计:量程 0℃ ~-100℃,精度±_℃4.5微型离心管：1.5ml经高蒸汽火菌，微量移液器:量程 0. 5 μL-~1 C00 μL.c4.6
4.7扇头镊
4.8肢萃研棒或塑料耐磨棒、
4.9恒温箱：85℃11
4.10水浴锅;室湿~100℃。
4.11期料封口机：可满足，rrr以上杂交袋热翘对口，落液溢出到电阻丝或外壳上时不公发牛漏电。4.12暗盒：可用任何能避免强光直射的盒子或袋子代替。4.13硝酸纤维素膜，
4.14杂交袭。
4. 15 洗涤血; 径为 5 cm 和 S cm 的平Ⅲ4.16电炉或其他加热设备：可游是200m1.-~2000ml.水在口容器中沸腾ICmin。4.17望控石错划片机或常规于一切片：可划4μm~？m厚的石蜡组织切片。4.18程控组织脱水机或常规于二脱水。4.19程挤组织包埋机或常规手二包埋。4.20展片水浴锅：宰温~59°℃，2
4.21切片烘片机：室温～100℃
4.22切片柒色缸。
4.23切片保湿孵育箱。
5操作方法
5.1斑点杂交
SN/T 1151.6—2004
5.1.1取对坏的个体（适用于3cm以小纳虾、仔坏、幼体或受精卵）或对虾的胃或丝组织（适用于活体或冷流的戒虾)样品约 0. 「 g,置士 1. 5 tmL. 微型离心管中,人 0. 3 r:I, SFMP-1.-is研磨液,用磨整将样品充分衙磨后,8 000 r/min-10 0c0 r/rin离心2 min,段上清液备用。5.1,2根据得检详品数量以及阴件对照利阳性对照，隔养衬纸在确较纤维素膜1.用软铅笔划格，旬详为5 rmm×5rmm小格,淤柜线将所需人小的杂交膜剪下，一式两张：左.F角剪角的一张为测试膜，左角用软铅笔点点标记的为对照膜，5. 1. 3 将测诚膜利对照膜颤浮于双蒸水表而,使其沉人水户吸水 10 min,然后没泡于 20 × SSC 中5 =nin.最出膜置十滤纸 I.晾干-5.1.4将5，1.1中样品上清液（包括阴性对照和阳性对照）在100℃水浴中点沸10mi，然后迅迷置下冰水浴中2min以上，稍离心，作晾十的测试膜和刘照膜相应方格内点样,每样1l，自然晾十。5.1.5将测试膜和对照膜夹丁闷张遮纸中间，放丁80C烘箱中烘烤2片。5.1.6根据测试膜和对照膜的面科大小备所需的预杂交液（0.2ml/cm2）.63℃条件下不断搅司溶解。
5.1.7将5.1.5测试膜和对照膜分别置丁两1杂交袋中，加人 5.1.6中溶有封闭剂的预杂交液,过口，在65℃水浴孵育2h。
5. 1. 8获 1 ml. 预杂交液而要 20 ng核酸探深饣计算,收出总核酸探需用量,置于一只微量离心管中;在100C沸水中煮探针：0ttitn，尔后置士冰水中猝冷至少2t:ii5.1.9剪元5.1.7中测流膜杂交袋-角，加人5.1.8它已变性的探针,封几,泥匀袋巾液体，65℃水欲中孵膏 6 b~15 h
5. 1. 10完全剪元杂交袋,取出 5. 1. 9中的测诚膜利对照膜,室湿下,在平Ⅱ中用 2义SSC/0. 1%SDS洗涤测试膜和对照膜两次每次5rmin,间歇措，5.1.11根据测试膜和对照膜的面积人小准各所需0.1×SSC/0,1%SDS(0.5mL/cm)；取出 5.1.10中的测试膜和对照膜，分别置于两！新的架交袭中，用缴量移液器加人0.1×SSC/0.1%SLS,65℃水浴中孵育15min，然后疾杂交袋，再用微片移液器加人0.1×SSC/0.1%SIDS，在65℃水浴户孵育15min。5.1.12妆出禁交袋牛的测宗膜和对照膜,室温下,在半血中月1×Bu三cr1洗降测试膜和对照膜两次，每次2min，间歌摇晃。
5. 1. 13将测试模和对照,模分别装丁两！新的杂交中,加人Buffcr Ⅱ ,室溢放置 30 min。5.1.14剪开两个亲交袋一角，分别加人杂交袋内 Buffer1：5c09体积的碱性磷酸海标记的IG菀体(C.2 μL/mL),封厂,在振荡器上空温振荡30 min5.1.15完企剪万杂交袋取出测试膜和对照膜,在半m中用1×Buller【洗椽两次，每次二5 min,并间歌摇光。
5.1.16取出测试膜和对照膜、在平而中用1×Buffer 血洗涤2 rnixr,并间欧光将5.1.=6中的测试膜利对膜分别装于两只新的杂交袋中，均加人显色液I(0.2mL/cm）5. 1. 17
载口，置丁处显色15 min～2h。在显色过程中，可短时间取出测试膜和对照膜观察，勿搅动，返察后立即放回
5.1.18在测试模上阳性对照样品明显山现颜色且测试膜和对照膜有所变免时，立即剪开杂交袋，山SN/T1151.6—2004
膜，置于蒸谱水中漂洗15 min～3 rmin 以终止显色.将膜置于滤纸「:晾干：对光观察，记录结果、5. 1.19统果判定;
检测结果的判定要将测试膜与刘照膜刘照逊行：测试膜上阳性对样品的显色应为些褐色，阴性对照栏品底为无色。参照膜上附性对照和阴性对照均无色惑膜上出现黄色、红色等颜题色都不是病舞存在导致的显色结果。
测试膜「斑点显蓝褐也，而对照膜对应斑点不显也或颜色比测试膜「浅得多时，该栏品判断为阴性，该结果提示活虾和激感宿兰已被WSSV感染·或对虾产品及其他产品曾被WSSV感染：测试膜斑点不显色：该样品判断为阴性：阅试膜与对照膜均有期显留题色，则该样品出丁样品处理的间题存在明显的非得异性反「扰，测试结果法判断结果可时，可补充组织病学诊断或PCR技术诊断或原位杂交技术诊断。5.2原位杂交
5.2.1将流的对虾个体(适川下行虾,幼休或受精卵)置于IDavidlson's AFA固完液中回定；对于活幼虾或成虾，则月净锋利的刀片将其头滴部切为两半，将其一半置丁Iavirisnn’：AIA再定液中固,24 后臂70杀乙醇。
5.2.2将样品置士程控组织脱水机巾进行脱水、透明、浸蜡，在程控石错包埋杭1逆行包垣（也可使用手工脱水和包埋步骤）.用石蜡切片机进行切片，厚馒5I,用毛笔将划片移入展片水浴锅内展片，用已预包被500mg/1mL多聚懒氢酸裁皱片捞出，置于污片烘片机42℃烘烤30riizl5.2.3将组织切片（包活阳性对照和阴性对照）在切片染色台中依次通过二币米（3次，5min/次）、纯酒精（2次，1m:n/次）55%酒精（2次，10s/次）.80%酒精（2次，约10s/次）50为酒精（约10s）蒸耀水冲洗6（勿让切片十蝶）
5.2.4将组织切片平放在切片保湿孵育箍中，吸50CμL蛋白酶K工作液，滴加于每张组织切升[37℃下孵育15mir
5.2.5用微量移液器组织片上的蛋白嗨K工作液吸下，然后为其放人烯有0.1为的冷干醛溶液的切汁染色缸中,温浸洗压min。
5. 2. 6取高组织划片,置一有 2×SsC 的划片染色缸中，室温浸洗5 trtit。5.2.7把5.2.6小的组织钙片平在片保混孵育箱，用微量移液器吸50℃杂交缓污液，滴加士衔张组织切片.1，42℃下孵育30 min5.2. 8安每张切片需要 25 ns核酸探计算，取出总核暧探需用量，置丁一只微量离心管中，布1o佛水户煮探针9 min,尔置于冰水中猝冷5.2.9将5.2.8的核暖探针与相随量（每张例片需5C01L)的杂变缀冲液充分混合用微量移液器吸500μL溶有核酸深针的杂交缓冲液滴加于衔张维织切片.1，然后将组织切片叠于85℃-~90℃切片烘片机上保温 5 mir～lc min,使组织 DVA 变性:。5.2.10把组织切片放在冰上摔冷2 mir5mir。5.2.11将组织划片放在保湿孵育箱中内40℃~42%:下孵育过（16:~181），5.2.12用微量移凌器吸去组织切片「.溶有核酸探针的杂交缓汁液，然后在动片染色缸巾用缓冲液2×SSC(15 mir.室温),1XSSC(5 mn.室源)0, 5X SSC(2 次15 nin/次,42C),Buffer T(5 rli=r,室温)浸洗组织切片。
5.2.13用BufferⅡ或阅5.2.12中的组织切片（500rl/片），置丁保湿育箱中37孵育30 min5.2.14将碱性磷酸嗨标记的DIG抗体按】：1000落于Buffer户（1l./ml.),用微量移液器坡去5.1.13中组织切片上的BufferI，然后招组织说片放在保湿察窄箱中，给每片组织切片上加25CL溶有碱性磷酸酶标记的Dlt抗体的 BuiffetⅡ,37:孵育 30 rit5.2.15从保湿孵育箱中取出组织切片,而微移浚器吸除组织片上的Buffc Ⅱ，然后在切片染包中依饮用1×[uer I2次，l0 min/次;率温)和」×3u至cr 而( min,率溢)没游组织切片。SN/T1151.6—2004
5.2.16用微量移液幕吸取500μL显么液，滴加组织切片1,温下黑陪中温浴1h～3h，在显血过程，可短时间取山纽织切片在显微镜下诞察，当阳性对照明显壶色时可缝止反应。5.2.17用微量移液器吸去组织切片上的显色液Ⅱ，空温下将组织切片置于1×13uffeIV中15min，以终止廊。
5.2.18在划[i染色缸巾依软用蒸谱水（10 *)、0.5/期麦棕-Y（1 t1it)95%酒精（3软，1)/次）、纯酒精(3欲,10 s/次）、二中苯(4次.1C s/欲)浸洗5.2,17的组织现片，5.2.19往勾一组织切片.F滴加两滴中性树胶，素片。5.2.29在壶微镜下纽织切片上的蓝黑色到黑色细泡沉淀物.并拍照。5.2.21结果判定：
受WSV 感染的细脑显示阳性反应，却细胞核内有较深的蓝黑色沉淀,而阴性对照的细胞核着为浅惊么。惑染程度堪深，则着色堰明显：对虾中壳「的显色是非特异性反应所致、如果加有核酸探针和杂交缓冲液的切片在85℃90℃平板烘片机二保温 6mir～10 min过程中,因缓冲液蒸发而使纽织下燥，下燥部分亦会山现非特异性反应：阳生对照样品不山现了些黑色到黑色细胞沉淀物，或阳烂对照样品和明性对照样品均吾现显免反应精当的明壶非特异生反扇，判断检测结果方效，应重新样检测。SN/T I151.6—2004
20XSSC
氯化钠(NaCI)
柠檬酸三钠(2H;0)
加双蒸水定容至
调pII 至
高压灭菌后 4T贮存。
20XSS0
双蒸水
0.45Rm滤膜过滤除菌
4℃贮存。
2 × SSC
20xSSC
双蒸水
0.45lm滤膜过滤除菊
4℃贮存。
A,4 1XSSC
2GXSSC
双蒸水
0.45m滤膜过滤除菌。
4℃贮存。
A.50.5×SSC
20XSSC
双蒸水
0.45m滤膜过滬除菊，
AC存。
A.6 10 × Buffer I
氯化钠(NaCl)
加双蒸水溶解，定容至
用斋酸凋节至
高压灭基后4℃贮存。
附录A
（规范性附录）
试剂配制
1 900 rnL
SC =nL
1 950 rnLwww.bzxz.net
1 000 ml
1× Buffer I
10xBuffef[
双蒸水
0.45滤膜过滋除菌
4℃存
A.8 Buffer I
封闭剂 Il (Bloc:kitg Reaget:l I)B-iffer I
在6c~80℃水浴中问歌兆动5 mizr~1 anin,完全溶解：A.910%SDS溶液
[二烷基磺酸钠(SL>S)
双蒸水
2xSSC/0.1SDS
20x ssc
10%SLS
加双蒸水定容至
0. 1× SSC/0. 1%SDS
2GXSSC
16%SDS
加双蒸水定容至
预杂交液
Bocking Reagenl I
2c%+二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl）10%SLS
1co rnL
15 μL
作 5G℃~-80水中问歇显动5 mim~-1Gmin,宠全溶解。CxBuffer I
氯化钠(NaCI)
圳双蒸水辫解至
用浓盐鞍调节I至
氯化镁(MgC·611z0)
加双蒸水定容
0.45m滤膜过滤除菊
4℃贮存。
SN/T 1151.6—2004
SN/T I151.6—2004
1× Bulter Ⅱ
[G× 1rffc:r
双蒸水
0.45m滤膜过滤除菌。
4℃购存，
75mg/mI.NBT溶液
四氮噬蓝（VBT)
二中基斗酰胺(DMF)
效蒸水
一20℃贮存。
5C mg/mI.BCIP溶液
5-溴-4-氯-3-吲柴磷酸-甲苯胺趾(BCTP)二中基平酰胺(DMF)
一20℃存。
显色液I
IX Buffer I
75 mg/nLNBT 溶液
5G mg/mLBCIP 溶液
C保存。
Davidsun'sAFA固定液
95%乙尊
37%甲醛
冰乙酸
双蒸水
空温保存。
95C0ug/mL多聚赖氨酸包被液
多聚巅氨酸（分子录大丁1500G0）双蒸水
落解后，4保存，用内用完。
1C×TE
腔甲甚氢基甲烷(Tris Basc)
氯化钠(NaCl）
Z三胺四Z酸(EDTA)
效蒸水
而 5 mol/L. 盐酸调 μII 至 7.4,定容至 1 00c mI,高压炎菌M“保存，
0. 933 mL
0. 400 mL
Icotng
220 rnL
9co nL
A.211×TNE
IGXTNE
双蒸水
用前以 0. 45 μ11 的滤器过滤A.22蛋白酶 K(Proleinase K)原液蛋白海K(ProteinaseK）
双蒸水
分装于尤菌离心管中（0.25rmL/臂），一20℃下保存A.23蛋白酶K(ProteinaseK)工作液(100 μg/mL）萤亡酶K原液
分装丁无菌离心管中，1‘:保存。A. 24 0. 4%甲醛(Furmaldehyde)37%甲醛(Fornaldenyde)
双蒸水
4℃保存，倒掉前重复使用五次，10o ml
gco rnL
. : tnt.
A.25杂交缓冲溶液(Hybridliz.ation Buffer)(终体积50 mrl.)20XSSC
100/甲酰胺(Formaimde）
20 XTDe:rhatdis
[C mg/ml.继血精 DNA溶液
25%硫鞍首聚糖(1)r:xt:an si:latc)4℃保存，
A. 26 2C × Denhardt's 溶液
牛而清白蛋门(组分5)
水溶性聚蔗糖4Oc(FicollAC0)
聚乙烯比咯烷醇369（PVP360）
双蒸水
0. 45 \m的滤器进滤,4℃保存。A2725%硫酸聚糖（1extran sulfate)溶液硫酸菊聚糖(1)extran sulf=tr）效蒸水定容至
惩热搅拌片刻.使之溶解，一20℃保存。1C=nL
2. 5 tnt.
A,281C mg/mI.鲑鱼精DNA(salnon sperm DNA)溶液韩鱼精TNA(salot ptr:DNA)
双蒸水
250 tng
SN/T 1[51.62Q04
将 INA慢慢加人水中,加热并搅拌，直至完含溶解。高压灭菌。分装丁无萄离心管中，一2CC保存。9
SN/T 1151.6—2004
1G×Buffer V
Tris Basc
EDTA + 2H.0
灿双蒸水定容至
用盐酸调pH至8.0，高斥灭菌。4℃保存。A.30
1 × Bulfer V
[G×13uffc:r IV
圳双蒸水
0.45um滤膜过滤除菌。
4℃保存。
A311C%聚乙烯醇(Pnlyvinyl Alcohal)溶液IVA(30000--70000 MW)
双蒸水
[ 000 rl.
1co mL
搅拌使之溶解，如有必要加热。分装于无菌离心替，1C mL/，一20℃保存2显影液I（DevelopmentSolution）A.32
[× nffer T
IC%PVA
三旋咪哪(Levarisole）
1℃保存
用前每 1 mL 以上混中.5μ NBT 和3. 5μl.BCIP。0.5%碑斯麦棕-Y(HisimarkHrowmY)溶液A.33
兜斯棕-Y(Bistmirk Brown Y)
双蒸水
把染料溶丁水中,过滤,宰溢保存，10
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