【商检行业标准(SN)】 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T0184,1-—2005
代誉SN0184--1993
进出口食品中单核细胞增生
李斯特氏菌检测方法
Detection of Listeria monocytogenes in foods for import and export2005-05-20发布bZxz.net
中华人民共和国
国家质量鉴督检验检疫总局

2005-12-01实施
SN/T 01B4. 1-2005
本标准对SN0184-1993《出口食品中单核细胞增生李斯特氏当检验方法进行修订。本标准自实施之目起，SN0184--1993同时度止。本标准与SN01841993比主要修改如下：-按照GB/T1.12000对标准文本的格式和文字进行修改；修改和规范原标准中的“设备和材料”，增菡培养蒸山EB增菌改为Fraser肉荡：\-选择性培养墨出OXA或MMA改为OXA琼脂和PALCAM璇脂，增加了API鉴定试验可代替生化试验和协落血试验，增加了用VIDAS金自动免疫荧光酶标分析仪作快速筛选：一取消了小鼠游力试验，
本标准的附录A为规范性附录，
本标证由国家认证认可监督管现委员会提并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫同。本标准主要起草人，于兵、麻丽丹、焦阳、尤永莉、张勇、陈晓东、杨绍新。
SN/T 0184. 1
进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菡检测方法本标准规定了进出口食品中单核细胞增生李斯特氏随的检测方法。本标准适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标雅的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓厨根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。扎是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28-2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂SN0330-1994出口食品中徽生物学检验通则3设蓄和材料
3.1冰箱4℃~-20℃，
3.2恒蕴培养箱：30±1℃.24℃±1℃.35℃±1℃。3.3恒凝水浴锅，46℃±1℃.50℃±1℃、80℃±1℃。3.4均质器。
3.5显微镜10X~-100×。
离心机:4 000 r/min.
3.7天乎：0g500g，精度0.1g.
3.8VIDAS全自动免疫炭光酶标分析仪。注，VIDAS全自动免接获光醇标分树仪起由法国梅里埃公可诞供的产品的商品名，络山这俄忠是为了力便本标准的使用考，并不赛示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相间的效采，购可使用这些等效产品，3.9商压灭藕锅。
解剖镜。
催形瓶：100mL、500mL
灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mlL（0.1mL刻度）3.12
3、18
灭菌平Ⅲ，直径90mm。
灭菌试管：16mm×160mm。
离心管：30mmX100mm。
单核绷跑生李斯特氏樊标推株。绵羊李斯特氏菌标准株。
英诺克李斯特氏菌标准株。
西尔李折特民菌标准株。
培养基和试剂
除另有规定外·所用试剂均为分概纯、水为猴留水。4. 1含 0.6%醇母没臂的映酪大就肉汤(TSB-YE):见第A.1章。
SN/T0184,1—2005
4.2等0.6%酪母没酱的斑酶大豆琼脂（TSA-YE).觅第A.2章，4.3Fraser肉汤增菌液（FB.FB):见第A.3率。4.4PALCAM琼胜魔第A.4章。
4.5OXA琼脂：见第A.5章。
4.67羊血琼脂：见第A,6率。
SIM动力培养基，见第A.7意
三糖铁(TSD琼脂：按GR/T4799.28-2003中4.25,4.27。4,9避盐培养基：按GF/T4789.28--2003中3.17。缓冲葡毒磷蛋自膝水（MR和VP试验用）按GB/T1789.28--2003中3.4。4.10
糖发酵培养基：见第A.8章
过氧化氢酵试验：按G3/T4789.28-2003中3.20。盐酸川啶黄溶液：见第A.3.2.1章。恭啶酮酸钠盐液：见第A,3.2.2聋。柠横酸铁铵溶液，见第A.3.2.3章。VIDAS单核细胞增生李斯特氏菌测试条。4.16
注，VIDAS栈细地增生李频特氏谢测试条是由法国海里换公司提供的产品的商品名，给这信必足为丁为便本探满的使用者，并不示对该产品的认可，妞采其他等效产品开有相同的效，则可使用这些等效产品。AP李渐特长菌鉴定条。
注，AP掌斯特氏齿整定条是由法国期果埃公司提供的严品的商品名，给出这一销忘是为了方便本标推的健用者。并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有栅输的效果。则可体雅这些等效产品。5检验程序
单核细瓶增生李斯特氏荫检验释序见围1。垃￥25#25mL）
FB增菌视225mL
30c.25h±1h
按议领生产广的说明采取
VDAS快道特选法
7nin可变初步缺果
朗炜·8.2搭面
1mL转种20mL.FBg增调液
30℃,25±1h
选养比塔养基(OXA,PALCAM)
性，期6.4利6.5分笑定
高离试险
应试验
报咨结集
35c,2h48h
携速可能随落，接格TSAYE
生化试验成
API鉴定试验
乐素酵水解，硝酸益还液。
LMR-V，第多剪：
爽牙销，限孕献，
单核细胞增生李斯特氏葡检验程序亲意闻
6检验步骤
6.1样品的存放与制备
SN/T 0184, 1--2005
如为冷冻样品，应于2℃~6℃解冻，且不超过18h：若不能及时检验，应罩于一15℃保存。非冷的易离样品应尽可能及时检验.若不能及时检验-应置于4C冰箱保存，在341之内检验。无菌最样品25&FB,增菌液225mL放30℃二1C培养25h+1h.吸取1mL，加入10ml.FB.增菌液中放30C土1r=次增菌25h±in。
6.3VIDAS快速筛选
取FB增菌，可按仪器生产厂的说明采取VIDAS快速筛选法进行快速筛选检测，75min可获初步结果。对于筛选为阴性的结果可直接按8.2报岱末检出单梭细胆增生李斯特氏菌，对于筛选为阳性的结果，应按照6.4和6.5的条款逊行分商塔养和案定。也可不经快递筛选，直接按照6.1和5.5的条款进行分离培养和鉴定。6.4分离培养
6.4，1选择性培葬基的分离培养取增菌液一环，划线分离乎选择性培养基OXAPALCAM琼脂平板.上，35℃1=1C培养24h~48h。
6. 4. 2瓣色落观案
李斯特氏菌在0XA琼脂平板上生长24h后菌落显现黑色，直径为1mm，在其网厨形成一个黑色环，培养48h，菌落仍显照色，直径2mm~3mm，除在菌落周围有一环外，在谢落中心部位的探层也形成无点。幸期特氏菌在PALCAM球脂乎板上与在OXA琼脂乎板工菌游相似。在OXA琼胎平板和PALCAM琼暗板上挑取5个或奥多可疑菌落，接种于1SA-YE孩脂平板上，纯培养后进行鉴定。
6.5鉴定
6.5. 1蓝色葡落检验
用45斜射光照射TSA-YE琼脂平板，函落星现蓝灰色到避色。用标雅菌株作为阳性对照，特纯化后的菌落接种于TSB-YE肉汤，35C培养24h，供生化等项日检验使用。6.5.2典型运动镜格
挑取在TSA-YE琼脂平板上生长良好的菌落于沾净裁玻片上·用0.85%灭菌生理盐水制成愁浮誠，玉上溢玻片，于显微镜下用洲镜观察，李斯特氏留为短转状杆菌，可见轻微的綫转翻滚。用标准菌梯作为对照。
6.5.3革盐氏染色
按照GB/T4789.28—2003进行苹兰氏架色，斯特G尚堂摄杆状革兰氏H性反应。6.5.4过氯化氨醇试验
挑取TSA-YE平板的谢落于消净载玻片上-滴折1滴3%的过氧化氢（H.O.）溶液，李斯特氏菌过氧化氢醉阳性反应。
6.5.5溶血试验
将7%羊血原脂平版底面划分为20个～25个小格，得格期种一个菌落。从每个TSA-YE琼脂乎板上至少挑取2个消落刺种血平板非射种阳性对照菌（单核细跑增生李斯特氏菌和绵羊牵斯特氏菌）和期性对照菌（英诺克李斯特氏菌），30℃培养24h~18h。穿刺应刚刚透过掠层，尽量避免接触平板底部时太凝烈和使琼脂破裂，于明宠处进行观察，单您细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏南在刺村点用随产尘窄小的透明型溶妞环，纳羊李斯特氏菌产先大的型游血环，其他李斯特氏菌种不产生游
SN/T 0184. 1--2005
血环。
6.5.6动力试验
将TSB-YE肉汤培养物穿潮接种于SIM半固体培养基.于窄源（20℃25℃)培养48h。李斯特氏菌育动力，在半阅体试管内量典型念状生长。6.5.7硝酸盐还原试验
用TSB-YF肉汤培养物接种于硝酸款肉汤中手35℃搭养5d.册入0.2mL试剂A，再训人0.”ml试剂B.轻据混合，如在1min-含mit内山现红色，判渐为阳欲反应：如果没有颜色显现，在含有试剂A和试剂B的试签内再加人少费锌粉（约20m，放置11，如出现色，表忘仍有碱酸盐存在，木被细菌还原，判断为谢性。
6.5.8 MR-VP试验
将TSI-YE肉须培养物接种于MR-VP肉汤中，于35℃培养48h。移取1ml.培养物于语净试管中.加5%a-禁溶液0.5mL，再加4%氧化钾游减0.2ml.轻轻摇动试管约1min，静置约20mirt.出现红色为VP阳性反应：将剩余琦养液维续子35℃养48h加甲基红指示剂】滴于试管中、出现红色为MR阳性这应。率斯特托函均为MR-V产阳性反应。6.5.9兰糖铁试验
用TSB-YE肉汤培养物接种F三糖铁原胎（TS1，35C培养5，李斯特氏菌在斜面和底层产酸，不产硫北铖（H.S)。
6.5.10镰发酵试验
将TSB-YF内汤培养物分别接种于0.5%箱密耕、麦芽糖、七吓省、售露醇、服李糖、本糖发酵管内，于35℃培养211~48h.附性继线培养到第5天，李斯特氏菌不产气，其不同邀种生化及应见装1李斯特氏葱菡种临别特征
菲兰氏浆色
中文名
单核细胞增长
斯特民
绵羊李斯特氏菌
英诺克事斯待氏露
L,monocy
logenes
L.ivunurii
etshimer
戏尔斯李斯待氏黄汇，
西尔李斯特民菌
格民李撕持民诺
绍羊动穿刺。
L.seeligori
Lagravi
+友质不定。
化纹醒
谢力试
酸盐还
#试骏
管技筑绘
不严S
不产s
产酸，
不产H.s
产题。
不产H.S
产酸，
不产s
精发酵利用
淡芽糕
职李献
6.5.11尿素酶试验
用TSBYE内汤培养物穿接邦于尿素球脂瓶上.于35C璃菲5.逐日规孕斯特出星尿茶酶试验研性反应·斜面无颜色变化，6.5.12协间溶血试验《心AM）
在羊血琼情平板上各划一置线，使两线平行·在两平行线上分别秘种3型游血金葡色葡商球菌
SN/T 0184. 1—2005
(S.aures）：ATCC49444和马红球菌6.5.13AI鉴定试验
AP1鉴定试验可代替6.5.7~6.5.12试验。其体方法：检查6.5.1~6.5.4中符合李斯特氏菌特征的梯，传代分离于7%羊血琼脂平板，按APlListeria鉴定系统说期书所述方法进行整定，应用说明书提供的数像缔码裘摄到鉴定绪果。6.5. 14血清学检验
将TS-YE肉汤培养物接种到3nI,TSB-YE肉汤中，于35C珺养21h:接种2支TSA-YE琼胎斜而，于35℃培养24h，用3ml.0.01m1ol/L磷酸盐缓冲液将斜雨菌苔洗下，菌悬液于80℃水溶中加热1h.以2500r/min离心30nmin.弃去2ml.上消液，将剩余液与沉淀港勾制成菌赵液.进行盘消学玻片谣集试验。
举斯特氏菌种的前清型见装2。
囊2李斯特氏菌菌种的血清型
中文名
单校纸胞增生车斯待氏前
缩羊车斯特氏菌
英诺克举斯特氏谢
尔斯李斯特氏药
阿尔李斯特氏菌
格氏斯特氏菌
Un来命名。
质量控制
I., inunuelogres
f., inroer
L,iona
L,seeligeri
Lgrayi
血清型
1/2A,1/2B.1/2C.3A.3B.3C,4A,4AB.4B,4C,4D.4F.75
JAB.6A,GB,Un*
12B.1e.dD.6H.Un
每次检验均诺用标准阳性菌袜和阴效蘑株（如托菌或链球菌等）进行质量控制，在6.2样品制备的同时，在一个作为空白对的FB，增凿液中加人新鲜配制的每旁升含有10个～100个单核细胞增生李斯特氏菌的阳性标准菌株培养物帮群波1mI.和阴性菌株培养物·按检验程序进行同步检验。8告结果
8.1协间资血试验、血消学试验可根据需要进行.常规检验可不进行这些试验。8.2单核绷胞增生李斯特氏菌与其他李斯特氏菌种的鉴列见表1。8.2.1报告阳性结果，检出单核细抛增生李斯特民菌。8.2.2报告阴性结果：未检出单核细胞增生李斯特民菌。
SN/T0184. 1—2005
附录A
(规范性珊录）
培养基
含0,B%酵母漫膏的膜酷陈大豆肉汤映酪蛋白豚（或膜白陈）
披物蛋白陈
磷二氢钾
葡萄瓣
酵母没离
A. 1.2制法
1 000 mL
将上述各成分加热煮沸裤解冷却后,调pH案7.1~7.5.分装,121C灭菌凿15 mia,备用。含0.6%酵母漫膏的跌酸陈大豆琼瞩(TSA-YE)A.2
A.2.1碱分
酪蛋白陈（或脾蛋白陈）
植物蛋白藤
氯化钠
母没育
蒸馏水
A.2.2剧法
1000mL
除琼脂外，格其他各成分期热煮沸溶解冷却后，调pH至7.1~7.5，再始人琼脂，121℃灭菌15min备用。
A,3Fraser肉汤增首渡（FB,FB,）A.3.1股分
蛋白酵消化物
劲物组织酶消化物
牛肉没膏
醇母没育
氟化钠
解酸二销
磷酸二氮钾
七叶苔
氯化理
蒸馏水

SN/T0184.1--2005
A.3.2制法
将上述成分置于50℃水裕中充分解，冷却后调pH至7.0~?.4，分装，121℃灭菌15min。A.3.2.1盐酸吖啶黄溶液
盐酸吖啶黄
灭菌蒸馅水
振摇混匀，充分解后过滤除菌，避光保存。A.3.2.2噬酮酸钠盐溶液
萘噬酮酸
0.05mol/L氢载化快游液
振摄混句，充分溶解后过滤除菌。A.3.2.30.05nol/L氢氧化钠溶液氢氧化钠
灭蘭蒸馏水
振播混匀,充分溶解。
A.3.2.4柠模酸铁铵溶液
柠橼酸铁铵
灭菌蒸瘤水
振据混好，充分溶解后过滤除菌。20mg
A3.2.5Fraser肉汤1(FB）1000mL中期人：5ml.
盐酸吖雌黄榕藏
蔡啶酮酸锅盐搭液
柠檬酸铁铵溶减
A.3.2.6Fraser肉汤I（FB,)1000mL中加人：盐酸吖啶黄溶液
紫啶翻酸盐溶液
无菌分装于10ml大试管中。
A.4PALCAM琼膜
A.4.1成分
蛋白滕
酵母浸膏
氯化钠
D-葡葡糖
D-甘露醇
柠檬酸铁铵
七叶香
氯化性
蒸馏水
盐酸吖啶黄素
硫酸多粘菌素B
复达新
1 000 ml.
：
SN/0184.1-2005
A.4.2制法
除酸吖啶黄系、酸蛋粘菌素B、衰达新科脂外，将其他各或分加热煮沸溶解玲却后，调H至7.0~7.4，再加人琼脂，121℃炎菌15mim，冷却更50℃，无菌燥作.加人用适量无菌水溶解的盐酸吖啶黄索、硫酸多粘菌素B、复这新，摇匀，倾注平板。A.5OXA琼贴
A.5.1成分
强白藤
氯化钠
柠檬酸铁铵
老叶香
氟化锂
蒸馏永
吖啶黄素
头孢双硫噬甲氧
故綫菌酮
盐粘菌素
1 000 ml.
除吖啶黄素、头孢双硫睡甲料、放线菌酮、磷餐紫、硫酸盐粘菌繁和琼脂外，将其他成分加热煮沸浴解冷帮后，调pH室7.074，再加人琼脂，121灭邀15min冷却室50℃，起菌操作，加人用5mL.乙醇和5ml.无菌水溶解的吖噬黄索、头抱双碗唑甲氧、放线菌酮、磷爆素，摇勾，倾注平板。A.67%羊血球脂
A.6.1成分
窖0.6%酵母短膏的肤酷陈大豆琬酮（见第A.2草）脱纤维绵羊血
A. 6.2制法
1000ml
将1000mI.高压灭菌后的含0.6%酵母没薄的肤酪豚大喜琼脂（见第A.2率）冷却至50℃，加入70ml。脱纤维绵单血，边加达摇，均句混合后注平板。A.7SIM 动力培养基
A.7.1成分
多价膝
豌酸铁饺
磁代硫酸钠
蒸鳍水
A.7.2制法
1000 mt
将上述备成分加热灌勾，调H7.2.分装小试管，高压炎荫121C灭菌15min。6

A.8糖发酵培养基
A.8.1糖发酵基础液
A.8.1. 1成分
胰蛋白豚
牛肉没膏
氮化锅
漠甲酚紫
蒸懈水
1 000 mL
SN/T 0184. 1--2005
A.8.1.2制法
将除漠甲酚紫外的各成分加热溶解，冷却后调pH7.0，加入漠甲酚载，充分溶解，混合。A.8.20.5%糖发酵液
A.8.2.1成分
葡葡瓣
墨芽糖
鼠李糖
A. 8, 2. 2制法
将上述糖类分别加入糖发酵基础100mL<见A，11.1)，分装试管，每管1mL.于115℃高压灭菌15 min.
A.8.3七汁苷培基
A.8.3.1成分
膜蛋白豚
牛肉没素
毛叶替
柠酸铁铵
蒸擒水
A:8.3.2制法
将上逆各成分加热解，冷却唇调pH7.0.分装试管，每管1mE，于115℃高压灭菌15ning
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。