【农业行业标准(NY)】 油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定 高效液相色谱法

ICS 65.020
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1582—2007
油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定
高效液相色谱法
Rapeseed-Determination of glucosinolates content---Method using high-performance liquid chromatography(ISO 9167-1:1992(E)—Part 1,IDT)2007-12-18发布
2008-03-01实施
中华人民共和国农业部发布
本标准等同采用ISO 9167-1:1992(E)前言
NY/T1582
Part 1:油菜籽中硫试含量测定高效液相色谱法。为使于使刑，本标准作了下列编辑性修政；a）“本国际标雅\一词改为“本标准”；b）用小数点“\代替作为小数点的遵号“，”；）删除国际标准的前言。
本标的附录C为规范性附录,附录 A 和附录 B为资料性附录。本标准巾中华人民共和国农业部种植业管理刊提出并归口。本标准起草单位：农业部油料及制品质量监督检验测试中心。本标准主要起草人：李培武、张文、注第芳、丁小霞、李光明、胡乐华。1范围
油菜籽中硫代葡萄糖苷的测定
高效液相色谱法
本标准规定了采用高效液相色谱法测定菜籽中硫代葡葡糖甘含量的方法NY/T 1582—2007
本标准适用于油菜种了及商品菜籽中硫代葡萄糖苷含量的测定，不适用于葡萄糖分子被取的硫代葡葡糖首样品分析。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为水标准的条款：凡是注日期的引用文件，其随后所有的修政单千包括动误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据外标准送成协议的各方研究是否可使用这此文件的最新版不，凡是不注开期的引用文件，其最新版本适用于本标准GB5101粮食.油料检验扦样、分样法G6682实验室用水规定(GB6682—1992.cq1SO3696—1987)GB/T14488.1，油料种子含油量测定法（GR/T.14488.1—1993，cqV.ISO659—1988）GB/T14489.1油料水分及挥发物含量测定法（GB/T.11489.--1993-eqv ISO 665
3原理
用甲醇一水溶液（70一30），提取硫代简葡糖苷，然后在阴离子交换树脂上纯化并酶解脱去硫酸根，反相C社分高，紫外检测器检测硫代葡萄糖苷。4试剂
除非男有规定.仅使用分析纯试剂。4.1水：符合GE/T6682标准二级的规定：4.2硫酸酪酶Heliz pomatiaII1型(EC3.1.6.1),每毫升硫酸酯酶活性单位不低于0.5.硫酸酯酶熔液应即配即用。
4.3葡聚糖凝胶悬浮液：称取10DFAF SephadexA25聚糖凝胶，浸泡布过量的2tnol/L醋酸溶液中，静置沉淀，再加入2mo1/I醋酸溶液，直到液体体积是沉淀体积的2倍，于4℃冰箱中存放，待用。4.4甲醇-水溶液（70—30）：量取70m甲醇与30ml.水混合。4.50.02mol/L醋酸钠溶液：称取0.272么酷酸钠(CHCOONaHTT.O),加800rL水溶解，用酸调节溶波的 pII 至 4. 0,加水定容至 1 L.4.6.6mol/1.用酸咪唑溶液：称攻204g唑，溶解厂1.13mL甲酸中，待溶液冷却后加水定容至500mI.
4.7内标：用丙烯基硫代葡葡精苷（Mr=415.49)作内标；当样品中含有丙烯基硫代葡萄糖苷时，用苯甲基硫代葡萄糖背（Mr=447.52）作内标。当样品硫代葡萄糖含量低于20.0umo1/时，可将下述4.7.1至4.7.3中的内标物质浓度降低为1rmmol/L至3mmol/L。内标溶液在1℃的冰籍中可存放3周，在一18条件下可保存史长时间，内标溶液的纯度检定参照附录A执行。4.7.15mmal/L丙烯满硫化葡萄糖苷熔液：称取207.7m丙烯基硫代葡糖苷溶解于80mL水中，NY/T15822007
加水定容垒100mL：
4.7.220mimol/L丙烯基硫代葡萄糖并溶液：称取8.31.0mg丙烯基硫代筋萄糖省溶解于80mL水中，加水定容至100mL：
4.7.35mmol/L苯书基硫代葡蒂糖首溶液：推确称取223.7mg苯中基硫代葡萄糖苷溶解丁80mL水中，加水定容至100mL。
4.7.4201mnl/苯甲基硫代葡萄糖苷溶液：准确称取895.0mg苯甲基硫代葡萄糖古溶解于80inL水中，水定容至100mL：
4.8流动相A：超声波脱气30s的水。4.9流动B：取200ml色谱级乙睛，加人800mL水，混勾，超声被脱气30s5仪器和设备
5.1实验室常用仪器设备。
5.2研体或微型研磨机，
5.3丙烯离子交换微柱，底部筛板为100日，5.4离心机：带有10ml转头，并能获得5000×g的相对离心力。5.50.15um水溶性微孔滤膜。
5.6色谱柱：填料颗粒小于或等于10μm的反相Cis或C柱，例如：NovapakCis柱，5rutn(150mm×3.9mm);Lichrosorh Rp18柱,5μm(150mmX4.6mm);SplerisorbODS2柱,5μm(250mmX4m);LichrspherRp8柱.5urn(125mmX4mm).5.7高效液相色谱仪：具备梯度洗脱，柱温可控制在30℃，情紫外检测器。6试样的制备
按照（出5191的规定对试验材料进行缩分，将缩分后的试验材料分成三份，第份按GB/T14489.1的规定测定水分及挥发物含量，第二份接GB/T14488.1的规定测定含油量，第三份为硫代葡萄糖苷待测试样。
如果试验材料的水分及挥发物含量超过10死，应在15℃条件下通风十燥，将干燥后的待测试样在微型粉碎机中粉碎，过40目筛，然后立即连续完成了.1至7.2的全部过程。7操作步骤
7.1称样
分别称取200.0mg待测试样至A.B两支离心管中。7.2硫代葡萄糖苷的提取
7.2.1将离心管75℃水浴1min.加人2mL沸甲醇一水溶液(70十30)后，立即加入200ul.5mmal/1内标溶液率A管中，200μL20mmol/L内标溶液至B管中。7.2.275℃水浴10mir，其间每隔2min取出离心管在旋涡混合器上旋鸿混合：然后取出离心管冷却至室温，5000g离心3min，分别转移上清液至10mL刻度试管A'、B中。7.2.3分别向A.B管再加入2mL70%沸甲醇水溶液（70+30).75℃水浴约305，旋涡混勾后75℃水浴10min，其问每隔2min取出旋涡混合，取出离心管冷却至案温，5000g离心3min.分别转移上清至原刻度试管AB'中
7.2.4用水调节A、B'管中的提取浓至5mlL，混勺。此提救在低于一18℃的暗处可保存2周。7.3离子交换柱的制备
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每一个试样的提取波准备一支聚丙烯离子交换柱，垂直置F试管架上。取0.5mL充分混匀的葡聚糖凝胶悬浮液垒每一离子交换往中，注意不要使树脂黏在柱壁。静置待液体排干后，取2m.61I1o1/I,甲酸咪唑溶液冲洗树脂，排干后，再用1m1.水冲洗树脂两次，每次均让水分排干。7.4纯化、脱硫酸根
7.4.1取1ml提取液缓缓加入已准备好的离了交换微柱中，注意不能搅动树脂表面，待液体排下后，分别加入1mL0.02mal/L醋酸钠溶液两次，每次加人后均让液体排干。7.4.2加人100μL硫酸酯酶溶液至离子交换微件,35℃条件下反应16h。7.4.3分别用11nL水抑洗离子交换微柱2次，洗脱腰收集于试管中。7.4.4用水将洗脱液定容至5mL，充分混匀后，用0.45aum的微孔滤膜过滤，待进样，洗脱液在18℃暗处可存放1周。
7.5空自试验
用相同的样品进行相间的前处理，但不加内标物质，以检定样品中内标物质是否存在。7.6色谱条件
7.6.t仪器条件：流动相流速为1.0ml./min，柱温30℃.紫外检测器检测波长229mm。7.6.2洗脱梯度
7.6.2.1对SpherisorbCia柱，10μm(150mmX1mm)和NovipakChg社，5um(150tumX3.9mm).洗脱梯度见表1。
表1SpherisorbCe柱和NovapakCa柱洗脱梯度时间
15 min
20 min
流动湘A(）
对 Lichrusorb R:18 桂,5 μm(150 mmX4, 6 mm),洗脱梯度见表 2.表2LichrosorbRp18柱洗脱梯度
20 min
25 min
3C trsinl
流动相A(%）
7.6. 2. 3对 Licharosphcr Rp8 柱,5 μm(125 nn×4 mm),洗脱梯度见表 3表3LichrospherRp8柱洗脱梯度
2c min
25 ntn
27 thin
流动相 A(9)
流动和 B%)
流动相B(%)
流动相 B(）
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7.7色谱测定
进样量lu工，记录峰面积。
8结果表示
8.1单组分硫代葡萄糖苷含量的计算8.1.1以每克十基脱胎油菜籽中所含硫代葡萄糖苷的微率尔数表示;按公式(1)计算,计算结果精确到小数点后两位。
Agxn ×Kg×
式中；
T基脱脂油菜籽中硫代葡葡糖苷含最的数值，单位为微尔每克（unol/）；脱硫硫代葡制糖节峰研积的数值；内标峰面积的数值：
脱硫硫代葡萄糖甘-相对校正系数，见附录C：试样质量的数值，单位为克()；试样中加人内标的量的数，单位为微摩尔（no)；试样中水分、挥发物和含油量之和，以质量百分数表示（必)。()
8.1.2以每克脱胎油菜籽含标准水分及挥发物时所含硫代葡凿精苷的微摩尔数表示，按公式（2)计算。计算结果精确到小数点后两位，g××g×
我中：
Ag、As.nm、K.u同公式(I);
X(l-Ws)
脱脂汕莱将含标准水分及挥发物硫代葡带静节的含量的数值，单位为微摩尔帮克（mul/g);
Ws-…标准水分及探发物含量.以质量白分数表示，数为8.5%或9%。8.1.3以每克干基泄菜籽中所含硫代萄糖甘的微摩尔数表示，按公式（3)计算，计算结果精确到小数点后两位。
武中：
Ag、As.n.m、Kg同公式(1):
Agxn xKgx:
D3—T基油菜籽中硫代葡萄糖甘含量的数值，单位为微摩尔每克(umol/g）：W试样中水分及挥发物含最的数值，以质量百分数表示(%)。(33
8.1.4以每克油案含标准水分及挥发物时所含硫代谢萄糖昔的徽摩尔数表示，按式(4)计算：计算结菜精确到小数点后两位。
Ag ×# XKgX
X(1 -Ws)
Ag、As,H、m.KgUl,Ws同公式(1).(2)和(3)(4)
TM-油菜籽含标准水分及挥发物时硫代葡萄糖的合量的数值，单位为微摩尔每克（umoi/g）8.2硫代葡萄糖苷含量的计算
硫代葡出糖苷含显等于单组分硫代萄糖甘（单组分峰面积应大于峰面积总和的1%)含量的总4
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和，以摄克样品中所含硫代葡萄糖目的微摩尔数表示如果A.B两管硫代葡简糖苷含量的测定值满足9中精密度的要求，碰代简翁糖节的含量为两测定值的算术平均值。计算结果精硫到小数点后两位。9精密度
9.1向一试样、同方法、同一操作者、同仪器、间一实验室短期内两次测定值：如果硫代葡萄糖苷含量低」20.00zmol/g，绝对差值不大于2.00umial/g；如果硫代葡萄糖含在20.00μmol/g~35.00μmol/g范围内，绝对整值不大于4.00umol/g：如,果硫代葡药糖首含量人乎35.00μmol/g绝对差值不大于 6. 00 umol/g
9.2同：-试样、同一方法、不同操作者、不同仪器、不同实验室两次测定值：如果硫代菊糖含量低于20.00zmol/g：绝对差值不人于4.00gurmol/g=如果硫代微葡糖首含量在20.00imol/g~35.09imol/g范围内，绝对差值不尺于8.00umol/g;如果硫代葡萄糖苷含最天于35.00umol/g，绝对差值小大于12. co gemol/ g。
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检定方法
内标纯度的检定方法主要包括：雕录A
(资料性附录）
内标纯度的检定
用本标准规定的方法进行高效液相色谱分析；-用高效液相色谱的离子对技术分析完整的内标(不脱硫酸根的内标)；用气根色谐分析脱硫酸盐和硅烷化的内标，用芥子酶(EC3.2.3.2)水解内标，根据水解产物葡糖的浓度检定内标的纯度。A.2结果分析
如果用色谱方法检定内标纯度，当色谱图中主峰而积不小于总峰雨积的98%时，表明内标纯度符合本标准要求，bzxz.net
如果用酶水解力法检定内标纯度，当水解产物葡萄糖的摩尔浓度不小于内标糜尔浓度的98时，表明内标纯度符合本标准要求，5
附录B
【资料性附景】
.硫酸酯酶纯化及活性测试
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B.1硫酸酯酶,Helit ponatia H1型(EC3.1.6.1),每塞升提纯过的硫酸醇溶液其活性单位大于0.5。纯净度：按照B.2到B.4所描述的方法对硫酸酯酶进行提纯、活性测试和稀释。B.2取聚肉烯离子交换微柱5根，置于垂直状态.对每一微柱加足够最的离子交换树脂，使液体流十后，可得500μL.树脂为宜。对每一微柱倾注1ml.6mol/L甲酸咪唑溶波，再分别以1m山冲洗两次。B.3纯化
称取25.0mg硫酸酯酶，溶于2.5ml.水中，移取此液500L到B.2制备的微柱中（每一微社500uL树脂）用1.5mI.水冲洗微柱，液体排于后加人0.2ro1/L酸钠溶液1.5m并收集5个微杠的洗山液至“个小试管中。
液缩洗脱液：用MiliporePTGC11K25浸入式滤纸过滤，直到大约100L液体被保留（大于5000个分子闭的蔬酸酯酶没有被滤出），再加2.GmL水，用过滤方式再次浓缩，直到大约100L液体被保留，然后用水稀释至2.5mL，一18℃冰箱中保存已纯化的硫酸脂酶，待用。因使用时需要解冻，可根据每次使用所需最以分装的方式冷藏。B.4硫酸酯酶活性测试
B.4.1制备0.15mmol/L丙烯基硫代葡糖甘溶液，用缓冲液调pHI至5.8,并配制下述三种溶液：a）取1ml.醋酸至500ml容量璇中.用水定容。b）取1 mL乙烯肼垒 500 rmL容量瓶中,用水定容。c）将73mL溶液a与40mL落液b混合，并以液或液b调节该混合液c的pH至5.8，取3ml5mmol/I.丙烯蒸硫代葡萄糖苷溶液至100ml容量瓶中.以溶液c定容。B.4.2活性测试
用移液管吸取2mL丙烯基硫代葡萄糖苷缓冲液（B4.1)至分光光度计石英比色阻，调节分光光度计波长至229mml.比色血温度调节至30C比色开始即t=:0时，加50αL纯净的硫酸酯酶（B.3）至石英比色血，并立即观察记录仪，当吸收值不再改变（Ae)时停止记录仪，绘制过(=0点的切线，并计算△A/At斜璐
硫懒脂酶活性（即在30℃、pH5.8的条件下，每分钟生成1umol脱硫内烯基硫代葡萄糖苷的量）就是每毫升硫酸酯酶溶液的活性单位，用下式表示：1001
武中：
U——硫酸酯酶活性，即每毫升硫酸酯酶溶液的活性单位；AA/t一过t=0点划线的斜率，以每分钟的吸收值表示：参与反应媒体体积，单位为升，即2.05×103L；(B. 1)
-L约1500L/（molcrn）在229nm处街分子丙烯基硫代葡糖苷与脱硫内烯基硫代菌Aa
商糖苷消光系数转换值，按式B.2计算。NY/T 1582—2007
式中：
A…一脱蔬丙烯基硫代葡萄糖仕在平衡点的吸收值与=0时吸收值的变化值；石英比色血直径，以cm表示，即1cr脱蔬丙烯基硫代葡萄糖昔在平衡点的浓度、以ol/I.表示，按式B.3计算：e0.15×103×0.95×2
式中：
=1.39×10-mol/L
丙烯基硫代葡萄糖苷在脱硫平衡点的产量硫鞍嘴酶的活性也可用式B.1简化公式来计算：U=MX5.?
AA/A,Ae同公我 1 和公式 . 2。B.5稀释
用移液管吸取1mL纯净的硫酸酶至10mI.容量瓶内，以水混勾定碎，将此潜液分成小最，贮存在～18℃的冰冻条件下.
附录C
【规范性附录】
相对校正系数
脱硫硫代葡萄糖皆的相对校止系数见表C.1.泰1
脱硫硫代葡萄糖苷的相对校正系数序号
靡代谢糖苷名称
2-羟基-3-丁烯基脱硫硫代葡积苷反式2-羟基-3-丁烯正碳硫代葡制糖苷丙烯基脱硫硫代葡萄糖苷
4-甲非孙丁基脱硫确代萄萄糖省2-羟基·4-戊烯基脱硫硫代葡萄糖廿：5-甲亚研浅基脱疏硫代者荷糖苷：3-丁烯基脱硫硫代葡糖
4 -羟基-3 -吲哚印基脱硫蔬代葡药糖作4戊烯基脱硫硫代葡萄糖竹
蒸甲基（华基）脱硫硫代类糖节3-吲陈目基脱硫代葡萄糖
紫乙基脱硫硫代葡菊糖苷
4-巾氧基3·引味甲述脱硫硫代苷萄糖谷1 -甲氧基-3吲噪甲基脱硫硫代背萄糖而其他
Cesulfoprugoitrin
ccsulfoepi-progoitrin
I tesulfosiznigrin
ccsulloglucoraprnint
cesulfogluconapo.eiferin
cesulfoglucoalyssin
Cesulfoghucoapin
tesulfn 4 - hyrl:oxyglucobrassicnGesulloglucobrassirarpin
tsulfghucorropacolin
tcsulfoglucobxaggicin
tiesulloghucunsturt:in
Cesulio-z-nethoxygluolrrssicinEesulfonenglhucnbressici:
nther desulfoglucosinolates
VY/T15822007
和对校止系数(Kg）
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