【商检行业标准(SN)】 蜜蜂白垩病检疫规范

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1938—2007
蜜蜂白垩病检疫规范
Quarantine protocol for chalkbrood disease of bees2007-08-06发布
中华人民共科和国
国家质量监督检验检疫总
2008-03-01实施
本标准的附录A是规范性闭录，附录B，附录C和附录是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并山口。本标准起草单位：华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主婴起草人：郑腾、孙颖杰、张志灯、白泉阳、赵兴存、王武年、季志方。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/1938—2007
1范围
蜜蜂自垩病检疫规范
本标难规亲了螯蜂白平病的检疫规范。本标理适用于蜜蜂白恶病的检疫,可用于蛋蜂蜂球衰菌的分离与鉴定。2规范性引用文件
SN/T1938—2007
下列文作中的杀款通过本标谁的引思实成护态标推的杂款是注H期的引用文件，基随店所布的修改单(不包抵勘误内容)或修讨版均不适用于本标准、然雨，鼓感据本标催达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版。成是不口期的引用文件，其最新版本适用于本标谁。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安企通用要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
蜂王 queen bee
又称母蜂，是由受精卵发育而成的生殖器宜发京完全的难蜂具三倍染色体，在蜂群中专司产，是密蜂品种种性的载体，并起到团结蜂群的作用。3.2
工蜂 worker bee
出受精卵发育而来的生殖器育发育不统全的雌性峰，是三倍染色体，有执行巢内外工作的器官。工肇在蜂群中个体最小.而数量却舌绝大多数，担负着蜂群内外的主要工炸。3.3
雄蜂 drone hee
由未受精的卵发育哺成的密藓，具单倍染色体，头近圆形，身体狂壮，体飞多而长，色深，翅大覆益整个体表。它是季节性密蜂，职能虑平衡性比关系和寻求与妈女王交配，只有在蜂群需娶时才出现。3.4
蜂巢honeyhee nest
密蜂繁衍生息、贮藏食粮的场所，出工蜂泌蜡筑造的1儿或多片与地面垂直、问隔并列的肿构成，巢聘上布满蛇穷。
巢脾comb
·般是由12日龄～18日龄的工蜂分泌蜡鳞筑造而成，每片巢脾称为子脾。从事造脾的工蜂，吸饱蜂密后连成串串蜂链，悬挂在造脾施工点或附近，数小时后，蜡液外泌到蜡镜并凝固成蜡鳞，经充分吡嚼并混人上疆腺的分泌物后,将成海编状的蜡块固定在巢脾上。3.6
封盖巢房cappedcell
在子脾上，封盖子一般位于巢肿的中下部，累房呈黄色，形状规则，轮廊清晰；封盖则位于巢肿的上部至两角向下发展，色浅，巢房轮哪不清晰，其波浪纹。方蜜蜂雄蜂房封證突出，似嫂头状。SN/T 1938—2007
4检验检接
4.1设备、材料和试剂
4.1.1设备
4. 1. 1. 1 光学显微镜。
4.1.1.2作滋培养箱。
4. 1. 1. 3超净工作台。
4.1.1.4药品冷蔽箱(2℃8℃)。
4.1.2材料
4. 1.2.1 无菌培养皿。
4.1.2.2载玻片。
4.1.2.3试管(10 mL)。
4.1.2.4无菌锻子。
4.1.2.5无齿解剖刀。
4.1.2.6无菌解韵剪。
4.1.2.7移液器。
4.1.2.8血球计数板。
4.1.3试剂
4.1.3.1试验用水：本标准所用水应符合GB/T6682中三级水的规格要求。4.1.3.2乳酸苯酚固定液(配方见附录A)。4.1.3.3乳酸棉蓝染色液（配方见附录A）。4.1.3.475%酒
4.1.3.50.85%无菌生理盐水
4.1.3.6马铃馨葡萄糖琼脂培养基（配方见附录A)。4.1.3.7醇母粉。
4. 1. 3. 8 氯节素。
4.2检验检疫方法
4.2.1现场检验检度
4.2. 1, 1 箱外检查
患病蜂群的蜂箱口可见被工蜂拖出的幼虫干户，质硬，有的干户吴花白色，似樊花仁状，表面有一层绒毛膜，擀幼虫干尸可觅内心为浅棕色；有的干户为部分或全部黑色，似西瓜子状，表面有一层黑色颗粒状物质(参见附录 B)。
4.2.1.2开箱检查
从患病蜂群的蜂箱提出幼业的封盖子脾，在已村盖的部分有星点式分布被工蜂咬开的巢房，可见内有向一侧贴壁的幼虫干户，形态完整，质地柔韧，无光择，无臭味，用摄子取出后，可见有的为口色，有的为部分或全部熙色。健康的密蜂幼或是呈有光萍、珍珠样外观（参见附录（)。4.2.2采样
4,2.2, 1采样比例
当蜂群数最小于或等于10群时.所有蜂群均采样。当数量在10群～100群时，以10群采样显为基础，每增加10群，采样量增加1群。当蜂群数量为101群200群时，按总群数的15%采样。当蜂群数量为201群以上时，按总群数的10%采样。采样时，每群蜂取10只～20只幼虫送实验室检疫。若现场捡验检疫时，发现蜂群疑似感染蜂球鞋菌时，可以根据实际情况，增加采样的比例。2
4.2.2.2采样方法
$N/T 1938—2007
从每个蜂群中随机抽取子脾一张，按照5点式采样方法.分别从果肿四角与中央各开启封盖幼虫房2个～个，观察是否存忠病纳虫存在。采样时，应尽最光商采集变色或死亡幼出尽快送实验室检直，推品可保存于2℃～8℃的条作下。4.2.3实验室检测
4.2.3.1镜检法
取虫户样品无苗培养Ⅲ中，片经消毒的解剖刀刮取样品表面物质置于1净的载玻片上，加1滴～2满无菌蒸馏水或乳酸苯酚固定液，在显微镜下观察，可见呈白色的似棉花的菌丝或黑色的含有孢子球的孢囊。也可用乳酸棉蓝染色液行染色，染色后虚丝量些色，4.2.3.2分离培养
无苗操作条件下，将虫群剪成1mm×2mm的小方块，了75为的酒精中消薄2min后接神于病原菌分离培养持（配方见附录A)平板上，35℃下培养5d一7d，逐H检查函丝生长和孢囊产生的情况，待孢袋产生后挑取孢接纯化至纯培养。芳还有采蜂密样品，舞个蜂样品取5ml，加人5ml0.85%的无菌生理盐水，充分混合均勾，在3个无菌培葬血中分别加人1ml.的稀释样，再加人约10ml.-15mT.病原菊分离培养基，35下培养：d～7d，逐口检查菌丝生长和孢囊产生的情说，待包变产生后挑取孢囊纯化至纯培养。
接种针分别挑收少置的菌丝和子实体置于载段片工，加1滴～2滴无菌燕馅水或乳酸苯酚固定液，在400倍一500借的显微镜下观察，可见树枝状分支的有隔苗丝和墨绿色泡塞，孢内含在许字大小不等的孢子球，破裂的孢可释改出大些的子囊孢子。也可用乳酸棉蓝染色液进行柒色，染色店菌丝巅。
4.2.4动物感染试验
以下试验应在严格的隔离设施中进行，并应符合（B10489中有关实验究的生物安企要求。将已分离纯化的蜂球囊菌接种于病原菌分离培养基，35培养5d～7d，得孢疆发育成熟并释放出子囊孢子时，用灭菌蒸留水将产生泡囊的函丝制或菌悬液，每升菌思液至少应含有2×10°个孢了。选用无病群健康的两力蜜蜂幼虫脾，以1日龄～2口龄健康的西方蜜蜂幼为试验对象，以灭菌蒸馏水为对照液，用移液器分别给健展的幼虫流喂菌悬液和对照液·滴袋最为2蜜蜂幼点经滴喂离悬液后，第1天至第3天无异带，感染幼虫与健康幼虫无明显区别。第4天起有部分感载幼虫出现死亡，随后每天的死门数量遂日增加，第6天至第7天时死亡鼠达到高峰。第10天在右死亡幼虫体璧开始长出户色尚丝，并始另苍白色继前发展为暗灰色，继续发熊变成低硬的石灰质块。
幼虫发病初期膨胀柔软.膜面出现菌丝，乐房降上也栏有菌丝。至期血体作满荫丝，较初期蒸缩工逐渐硬化，形状似粉笔块，部分虫体有黑色子实体股于体表，病至木期，部分虫体被成年工蜂拖出翼房，散布于箱底，箱门口或蜂箱前地百。留有白平病幼血户的巢房口被一层门色或淡黄色的菌丝封闭。
4.2.5结果判定
在现场检验检疫时，若见到案门闻、箱底或巢形上有长有自色菌丝或黑凹两芭的幼虫等临床症状时，可做出初步划斯。
在分离培养时，可见蜂球雍菌的菌落呈白色，较致密，中火凸起，菌落老化时颜色变放浅棕色至棕色。菌约多量分支状，二叉分枝间距较大，菌丝体呈疏松的蛛网状。的丝均匀具横腩膜，直径为2.54m～6.0F，菌丝细脑多核，雌性菌丝能长山有横隔磅漏离的藏卵器，雄性菌丝能形成体积很小的品纺锤形的藏精器，坐妞菌丝相交后几小时内即可形成黑色的孢了带·而同性菌丝相交处则没有熙包的孢子错，有时两性菌丝混合长成一个菌落，征征成为不规则的黑色孢子带。镜检时，蜂球囊菌的了实体为特征性的鉴定部位，墨绿色的范襄呈球形（参见附录D），自外向内有SN/T1938-2007
3层结构：最外层为墨绿色的闭裳壳.其中位衰着许多球形的子凳，子囊尤外膜，子燃中又有大量的痫圆形的子弛子，不同子囊累中子囊的大小和数目也有不同（参见附录D）。待了实体成熟后，了囊整消融，子龚孢子积聚成为孢了球，并被有外膜。了襄及带有孢了的子襄在该菌千长过程中很少见，一般得孢囊成熟，了衰壁已不存在，所以显微镜下看见的孢囊内的球形孢子团只足孢子球，每个孢子球的大小不一，内含的孢子数也不同。成熟的跑囊会自行破裂,释放出他子(参死附录D)。蜂球囊荫有两个变种，即大孢球囊霏和蜜蜂或囊，其区别在于成然的滋养细胞和跑鑫、孢子大小不同，两变种间彼此不能杂交。密蜂球握霉的孢粪直径通常为32um~99um.平均为65.5μn.孢子(3~3.8)μm×（1.5~2.3)μm大孢球囊链的孢整直径一般为 88.4 μm～168.5trm+平均128.4 μm,孢了比前者人10%。一般通过现场检验检疫、分离培养和镜检后，即可对蜜蜂凹垩病进行确诊。若需要时，可以结合动物感染试验，做出最终判断。
A.1乳酸苯酚固定液的制备
附录A
（规范性附录）
固定液、染色液和培养基的配方SN/T1938-2007
乳酸10mL，结晶苯酚10g，甘油20mL，蒸馏水10mL，将酚、乳酸、甘油混合，徐徐加热溶解即可A.2乳酸棉蓝染色液的制备
乳酸20mL，结晶苯酚20g.甘油40mL.棉蓝（水溶苯胺蓝）0.05g蒸馏水20ml，将酚、乳酸、甘油混合，徐徐加热溶解后，加人棉蓝混匀溶解，染色时，将染色液滴加于载玻片上，挑取待检菌于染液中，置显微镜下观察。
A.3马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备将去皮马铃薯200g切成片，加水1000mL，煮沸30mim~40min，过滤，将20g葡萄糖和20g琼脂，趁热加入溶化，调节pH至7.0.在0.105MPa的压力下，高温灭菌消毒15min。A.4病原菌分离培养基的制备
马铃薯葡萄糖琼脂培养基95mL.酵母粉5g.氯霉素5m，将以上各种成分混合溶解，在0.105MPa的压力下.高温灭菌消毒20min。S
SN/T1938—2007
附录B
（资料性附录）
蜜蜂白垩病发病蜂群的巢口死虫和病虫症状图B.1巢口死虫
图B.2病虫状态
附录C
（资料性附录）
密蜂白垩病发病蜂群的病脾状态图C.1病脾状态
SN/T1938-2007wwW.bzxz.Net
SN/T1938-2007
图D.1孢囊
SN/T1938-2007
附录D
（资料性附录）
蜂球囊菌子实体的显微图像
图D.2包含子囊孢子的子囊
图D.3破裂的孢囊
书号：155066：2-18193
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