【商检行业标准(SN)】 动物源性食品中醋酸甲羟孕酮残留量的检测方法 酶联免疫法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1959-2007
动物源性食品中醋酸甲羟孕酮残留量的检测方法
酶联免疫法
Determination of medroxyprogesteronc acetate residue in animal origin food-Enzyme inke immunosorbent assay method2007-08-06发布
2008-03-01实施
中华人民共和国
国家质讯监督检验检疫总局
的码防带
本标准附录A为规范性附录，附录3为资料性附求。标滩出国家认证认可监督管理委员会提出并码口。SN/T1959—2007
本标准起草单位：中华人民共利国天津出人境检验检度局北京中检维康技术有限公。本标雁主瑟起草人：刘烜、郑文杰、贺跑、这卫东、王雄、王、刘秀红。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。f范围
动物源性食品中醋酸甲羟孕酮残留量的检测方法酶联免疫法
本标准规定了动物源性食品中群酸用羟年调残留量的期联免疫测定方法。SN/T1959--2007
本标适用于帮肉、牛肉、鸡肉、羊肉等肉制品&鱼和虾等水产品中酸甲经孕配残留正的蹄选检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款道过本标准的引而而成为本标谁的紧款。凡是江注日蛎的引用文件，共随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订服均不适用于本标准，然，鼓刷根地本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注明目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。(B/T6882分价实验牢用水规格和试验方法3测定方法
3.1方法提要
乙酸乙能提取样品中醋酸开尧孕酮月间按宽争性降联免骏法进行检测。3.2试剂和材料
除书要求外，所有试剂均为分断纯，水为（1T6682规定的一级水。3.2. 1 甲醇
3.2.2乙酸乙酯，
3. 2. 3F己烷。
3.2.4光水硫股钠：650℃灼烧1h.在干燃器内冷却至室温，此于密封瓶中各用。3.2.5针简式微孔过滤膜（0.22m,水性）.3.2.6错酸甲轻孕酮酸联免疫试剂盒3.2.6.196孔板（12条×8孔）包被有醋酸甲轻予配和载体鲨白的复个物，3.2.6.2抗醋酸用孕酮抗体（浓缩液）：4℃保存，于使珂时用抗体移释缓冲液50倍稀释，抗体稀释8后不能继续使用
3.2.6.3标记物（浓缩液：端根过氢化物期和单抗免二抗的结合物，4像存，丁使用时用酶标稀罪缓冲液50倍稀释，酶标物稀释8后不能缩续便用，3.2.6.4洗涤液（浓缩液）按附录A配制。3.2. 6.5底物液 A,按附录 A配制。3.2.6.6底物液3.接附录A配制。3.2.6.710×浓缩抗体稀缓冲液（plI7.2)：使用前引蒸缩水稀释10倍。按附录A配制。3.2.6.8标稀释级冲液（H7.1)：按附录A配施。3.2.6.9终止液：2mol/1.硫酸水游液，1）韶酸甲经学照酷联免较吸附测定试剂盒出中检维所忙术有限公司提供的产品的商品名称。给出这一信息是为方便本准的使用者，并不表示对讼产品的认可。如采其位等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/1 1959—2007
3.2.6.10乙酸甲羟孕酮系列标排液（6个倍比稀释浓度水平,外划1个空白，3.2.6.11标准品忙备液：配制成1g/ml.H酸购备液，4心保存，低湿保存试剂，放置于室温不要超过4h使用时，各灌液应达到室。倍存有效期为1年。3.3仪器和设备
3.3.1均质器。
3.3.2天平(精确到0.001 )。
3.3.3组纠粉碎机
3.3.4离心机。
旋满汇合耀。
酶标议。
氮映议。
温分培养箱(5℃-60℃)。
3.3.9单道微量加样器:50 u11012～200 μ可调.200 1 C00 可调3.3.10多通道微氧加样器：动叫3.4制样
3.4.1样品制备
取样品约500g，将其切碎后，经组织频释机奔凝穿.内勾分成两份，装人沾净睿器内.作为试样。密封，并标明标记。
3.4.2样品保存
抽样后摔品应立即在-18℃以终透保存，0%~-5℃杀件下48h内送达实验室，在抽样和制择过程中，应防止桦品受到污染或发车残黏物奢些的变化3.4.3样品提取
称取 5 g<精确到0. 01 g)相粉碎椎点mL离心管中，加人5
无水硫酸.再加人20 ml,乙酸
乙酯，商速均质 1 min～2 min,振涝5系in。气吹十。
3.4.4样品净化
ao0r/min心1nmin。联上清液ml.于zoc氮蜜温下
用1. 5 ml.8c%的中醇/水溶期
烷，重复此步需恢。在0记氮气吹过滤膜(U,22 μm,水性)过滤，过行3. 5 酶联免症法检测
3.5.1试剂的制备
3.5.1.1乙酸甲羟孕酮抗体
1mL 正胞烷.振
悦脂,离心2 min,吸去正已
惠器的印静/提体森释缓净液溶残泄，将此溶液经微孔梭琚使用需要量，最最一定功站的乙酸甲羟孕调抗佐。消稀释好的抗体缓冲液按照1：50的比例求稀释抗体浓缩液。
：在吸最浓络液之南要仕细摇写·提供错快甲轻孕酮拉体为浓编液现川现配3.5.1.2羊抗免酶标二抗
是供的标记物为液缩液。由于稀释的标起韧的稳是性不好，仅矫释实际用品的醇标记物。在吸唆取浓缩液之前耍仔细勾用前标绶冲液按照1：前的比例来品释歸标记物。3. 5. 1. 3底物溶液
于混合后病物济液不稳定，需要在显鱼的临时暨。取等体积的A液和H液混金播使用3.5.1.4洗涤液
提供的洗涤液为10借浓缩液。使用前用蒸馏水将浓缩洗涤波稀释10倍使排，2
3.5.2样品测定wwW.bzxz.Net
SN/T 19592007
在酶标板中分别加人100达.不同浓度的甜酸甲择孕嗣标推溶液和样品待测液：作空白和对照孔中分别加人的抗体箍整证翰家自礼外在个孔中期人卫摇秤的抗体赖空白孔中赠加人0.抗体稀释缓冲液：轻拍混勾，闭精胶纸其性微孔以防落液挥发,37℃孵育30min。弃掉酶标板中的液体，卅洗涤液洗板次。加人稀释好的酶标记物液100社L轻轻混勾.37℃孵育30mi1。弃掉酶标板中的液体，用洗涤液洗板三次：加人混合好的底物液100μI，轻轻混匀牢温改置30 min后，每个孔加人50L的终止液，轻轻是动萨标板，10min内在酶标仪上读出罚孔450m吸光值，3.5.3空白试验
除本称取样品外，均按上述步骤进行。3.5.4监控试验
在每次测定均应做·个添加醋酸甲差孕醒标汇的扩品添加浓魔为应产品的检来战。3.6结果的计算
3.6.1计算抑制率值
计算不同浓度酷酸中轻孕颤对摄愿抗球粘这应的排制学见式（）..
式中：
IC一-酯酸甲羟孕酮对抗原抗体结合反应的抑谢率,%;E
酷酸中轻孙酮标准液或液的450nn吸究征的离值A标r
A2一不加人抗体及酷發印硬翻标随落的450m吸光值的平与试：Art
一末加醋酸甲经孕酮标雅漆激和样品静波加人抗体稀释游和标结合物的孔中450nm吸光值的平均值。
3.6.2绘制标准曲线
以抑制率为纵坐标,醋酸甲整孕酮洗度好数为垒标绘谢校正曲羲曲线.标雅两线参见图A.1。
3.6.3结果计算
得次试验均成配新绘制标准
从标雅曲线上读取样波抑制率斯对应的醋酸中轻孕酮浓授（，按戏2)让算试样中的酷酸单羟孕酮残留垫：
式小：
X-试样中酷酸中羟孕酮残留
，学位为微克每平克（
c-机据样品孔的抑制率在得试样也酷酸甲羟孕调浓度单做为微克何升（ug/1.)：R一-该样品的稀罪倍数，在本方法中该系数均为2。4捡低限，回收率
4.1检测低限
本方法检测低限为1g/kg。
4.2回收率
醛酸甲羟孕酮的添加浓度和间问收率的实验数糖参见附录B。实验结累为叫性应用仪器方法进行确证。SX/T1959—2007
A,110×浓缩抗体稀释缓冲液
附录A
（规范性附录）
试剂的制备
100 mmol/1.磷酸盐-9%氧化钠(NaC),pH7.2磷酸氢二钠(Na:HPO,·12H.U)
磷酸二氢钠(NaH,FO,H:O)
轻化钠(N(1)
谢 PH 值率 7. 2
用水定容至 0. 5 I.。
便用时，用水110稀释。
A,2薄标稀释缓冲液
10 mmol/L磷酸盐一0.9%氯化钠(NaCI),pI7.4磷酸愈二钠(Nl,HPO,12H.O)
磷酸二氢钠(NaH,PO·H,O)
氯化钠(NaCl)
调 pH 值至 7. 1
用水定穿至 0, 5 I.,
A.310×浓缩洗涤液
磷酸氢二钠(Na:HPO,·I2H.(0)
磷酸二氢钾(KH.FO,)
氯化钾(KCI）
化钠(NaC1)
Tween-20
加水定睿至100ml.究温保存3周~4周。丧用时,用水 1 ：10 稀释，
底物液
底物液 A：
磷酸氢二钠(NlHPO.·12H.O)
C.H.O, -H.0
30%双氧水（H20）
调 pH 值至 5. 0
加蒸溜水定容至100ml.。
底物液B：
3,3,5-叫甲款对二禁联苯(TMB)
C,H.O, *H.O
335 μtL.
二H基亚疯(DMSO)
甘池(丙三醇)
SN/T1959—2007
加蒸馏水定容至100mL。
使用前室湿避光保存。使用时，按底物液A：底物液B为】：1（体积比）混合使用。5醋酸甲羟孕翻抑制率标准曲线
长非拍线
度（）
醋酸甲羟孕酮抑制率标准曲线
SN/T 1959—2007
（资料性随录）
不同样品中醋酸甲羟孕酮的加标回收率表B.1不同样品中醋酸甲羟孕丽的加标回收率深加水平g）
回收率/%
50--80
100~110
82--86
70--100
64--88
56---86
70--110
G1 -81
72--76
70·~72
70--100
72--88
68-·86
Foreword
SN/T1959—2007
Annex A of this standard is a normative annex. Annex B of this standard is an informativa annex.This standard was proposed by and is under thc charge of Certification and Accreditation Acministra-tion of the People's Republic of China,This standard was drafted by Tianin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Re-public of China. , Clover Techngiogy Group Inc.This standard was mainly draffiedby.Xuan.Liu,Wenjio Zheng,Yen He,Weidong Zhao.Xiang Wang.Lian Wang.Xiuhong Liu
Thisstandard is a professional stanctara forentrfirst tirme.
inspectionand quarantinepromulgatedforthesN/T 1959-2007
Determination of medroxyprogesterone acetateresidue in animal origin food ---Enzyme linkedimmunosorbent assay method
This standard specifies the methods of determinatian by ELisA method of medroxyprogesterone ac-etate (MPA) residue in animal foods.This standard is applicable to the screen determination af medroxyprogesterone acetate residue inpork,bovine,chicken,lamb etc.and aquatic product such as fish and shrimp for import and export.Positive results should be confirmed by another method.2 Normative references
The following standards contain provisions which, thraugh reference in the text, constitute provi- sions of this standard. Parties to agreements based on this standard are encouraged to investigate thepossibility of applying themost recent editions of the standards indicated below.GB/T 6682 Analyse labaratary used water style and analyse method3Method of inspection
3. 1 Principfe of determinationMedroxyprogesterone acetate is distilled by ethyl acetate The basis af the test is the indirectly com-petitive enzyme-linked immuno-reactian.3.2 Reagents and materials
Unless otherwise specified,all regents are analytically pure. Water is redistilled water described byGB/T 6682— 1992
methanol.
ethyl acetate.
n-Hexane.
SN/T1959—2007
3.2. 4 Anhydrous Na, SO, : rying 4 h at 650℃ , cooling to room termperature in the desiccator,stored in sealed containerbeforeuse.3.2.5syringe droven filter(a.22 μm)3. 2.6 Medroxyprogesterone acetate detectian kit3. 2.6. 1 96 wells microtiter plate (twelve 8-wells strips) coated antigen which OvA canjugatedMedraxyprogesterone acetate.3.2.6.2Anti-Medroxyprogesterone acetate antibody (concentrated solution ).Storage at 4c,di-lute 50 times with antibocy diluent buffer. The diluted antibody solution is useless after 8 h.3. 2. 6. 3Goat anti-Rabbit 1gG/HRP(concentrated solutian ) : Storage at 4'C, dilute 50 times withconjugate diluent buffer. The diluted enzyme solution is useless after 8 h.3.2. 6.4Wash buffer (concentrated solution). see Annex A.3.2. 6.5Substrate A,see Annex A. 3. 2. 6. 6 Substrate B.seo Annex A.3.2.6.7 10 x antibody diluent buffer(pH 7. 2):dilute 10 times with distilled water before use. seeAnnex A
3.2.6.8Enzyme conjugate diluentbuffer (pH7.4):see AnnexA.3. 2. 6. 9 Stop salution:2 mol/L H,SO04.3. 2. 6. 10
Medraxyprogesterone acetate series standard solutions (6 concentration level and 13.2.6.t1 Medroxyprogesterone acetate standard reserve:1 μg/mL methanol,storage at 4℃All solution must be stared at law temperature (4'c ) never freeze and never be placed at room tem-perature longer than 4 h reach room temperature before luse.1) Medroxyprogesterore acetate detection kit is the commercial name which was provided by the clover Technol.ogies Co. , Ltd. This infornation being given is convenient for the user of the standard and is not the confimm ofsome products' protocol. Other products't protocol should be confirmed by experiments if any difference.SN/T 1959—2007
3. 3 , Apparatus and equipment3. 3. 1 Homogenizer.
3. 3. 2 Centrifuge(precisian 0. 001 g).3.3, 3Vibrator.
Microwell system.
3.3. 5Rotary evaporator.
3.3.6Qven(5℃60℃)
Pipettes,50 μL,100 gL.20 μL~200 μL+2003. 3.7
3. 3. 8 Multichannel pipette:50 μL3. 4 Preparation of Sample
3. 4. 1 Sampling procedure
About 500 g representative edible samples shoufd be 'taken frorm all samples.then grinded and blen-ronaogenops sampie and put m suitable clean containers.Afterbe-ded by a tissue blender to produ!ing sealed and labeled.
3. 4. 2 Storage of sample
After sampling,the test sampte shoutdbe stored Belc-intmediately and deliver to laboratoryat oc ~s'c within 48 h. In th&couirse af sampfing and sarpie'preparation.precaution must be takento avoid contamination or any factors which may cecause the change of residue content.3, 4, 3 Sample extraction
Weigh5g(precision0.D1g)of minced sample ina 50 mL glass centrifuge tube.Add 5g anhydrousNaz SO, and 20 mL ethyl acetate. Hamogcnize by tissue homogenizer 1 min~2 min.mix 5 min. Centri-fuge for 10 min at 4 c00 r/min,RT. Transfer 4 ml of supernatant in a clean glass tuba, dry out solventbyevaporation(undernitrogen.at4oc).3.4. 4 Sample purify
Resuspend the residue with 1. 5 mL 80% methanol. Add 1 rnL n-Hexane.mix 1 min.centrifuge for2 min at 4 Ooo r/min. take the n-Hexane out ,and repeat 2times. Dry out salvent by evaporation (un-10
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