【商检行业标准(SN)】 牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1999—2007
牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程
Protocol of antigen captured enzyme - linked immunosorbent assayforbovineviral diarrhoea-muscosal disease2007-12-24发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2008-07-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程
SN/T19992007
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
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电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
2008年2月第一版
印张0.5字数8千字
2008年2月第一次印刷
印数1-—2000
书号：155066·2-18459
定价6.00元
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：董志珍、侯艳梅、赵祥平、肖妍、霍蕾。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准SN/T1999—2007
1范围
牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验操作规程
SN/T1999—2007
本标准规定了牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获酶联免疫吸附试验（ELISA)操作方法。本标准适用于牛病毒性腹泻-粘膜病抗原的检测2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696）3原理
以边界病病毒特异性抗体包被酶标板，同时加入BVDV检测单克隆抗体及样品，样品即与两种抗体结合，形成抗原抗体结合物，洗板后再加人二抗（与抗原抗体复合物结合）及底物，通过测量光密度值而确定样品的结果。
4试验材料
4.1牛病毒性腹泻-粘膜病抗原捕获ELISA诊断试剂盒2℃~8℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：a）
牛病毒性腹泻-粘膜病病毒多克降抗体包被板b)
抗BVDV单克隆检测抗体；
BVDV阳性对照；
BVDV阴性对照；
辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体；10×样品稀释液；
10×浓缩洗液；
TMB底物溶液；
终止液。
4.2样品的处理
4.2.1组织
4.2.1.1使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在2℃～8℃保存1个月或长期冷冻保存。组织样品最好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏。4.2.1.2用剪子将1g~2g的样品剪碎（2mm~5mm）。4.2.1.3将剪碎的样品置于10mL的离心管中，加人5mL样品稀释液（1X），混匀，室温感作1h2h4.2.1.41500r/min离心10min，吸取50uL上清液作为检测用样品。按第7章进行试验。4.2.2外周血液白细胞
4.2.2.1将肝素或EDTA抗凝的血样10mL,2000r/min离心15min～20min。1
SN/T1999—2007
4.2.2.2用1000μL移液器小心吸取血沉表层的淡黄色薄膜，重悬于500μL的样品稀释液中，每一个样品换一个吸头。室温放置1h，在此期间偶尔漩涡振荡一次，下面继续4.2.2.6的操作。4.2.2.3如果样品的压缩细胞体积非常小，那么用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到10mL离心管中，并加人等体积的2℃～8℃预冷的0.17mol/L的NH,CI溶液，放入离心管中，室温放置10min。
4.2.2.4将离心管用2℃～8℃预冷的超纯水（或双蒸水）加满，轻轻地翻转摇匀，2500r/min离心5min。
4.2.2.5弃去上清液，加人500μL样品稀释液（1×）到血细胞中，每个样品使用新的枪头涡动混勾，室温中放置1h，在此期间偶尔漩涡振荡一次。4.2.2.62500r/min，离心5min，用上清液作为检测样品，按第7章进行试验。4.2.3鼻拭子bzxz.net
4.2.3.1取下拭子头，放人底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空）。将微型离心管放入另一个Eppendorf管中，25o0r/min离心5min。4.2.3.2弃去底部有小孔的微型管，并在Eppendorf管中加人与获得的粘液等体积的样品稀释液（1X）.混匀，室温下放置1h～2h。此期间偶尔摇晃一下，然后可按第7章操作程序进行试验。4.2.4细胞培养物
4.2.4.1弃去细胞培养液，反复三次冻融后，收集细胞培养液到离心管中，3000r/min离心5min，弃去上清液。
4.2.4.2加入500uL样品稀释液，振荡器上轻轻混匀，置于室温1h，吸取50uL作为检测用样，按第7章操作程序进行试验。
5仪器与设备
5.1酶标仪（波长450nm或双波长450nm/620nm）。5.2振荡器。
5.3高速台式离心机。
5.4冰箱。
5.5温箱。
5.68道或12道洗头洗板机。
5.78道或12道移液器（50μL，300μL）。5.8单道移液器（0.5μ~10μL；40μL~200μL200μL~1000μL和2mL~10mL）。5.95
吸头（10μ，200μ，1000μ）。5.10
剪刀和镊子（处理组织样品）。5.11Eppendorf管
6试剂准备
6.1试剂盒各组分在使用前恢复至室温（20℃～25℃）。6.2水：GB/T6682所规定的一级水6.30.17mol/LNHC溶液（提取白细胞用）。6.4洗涤液：用蒸馏水将浓缩洗液稀释10倍（1：10），如30mL浓缩液加入270mL蒸馏水，混匀备用。稀释用蒸留水应符合GB/T6682的要求。2
7操作程序
7.1加抗BVDV单克隆检测抗体
SN/T 1999—2007
用8道或者12道移液器在每孔中加入50uL抗BVDV单克降检测抗体（试剂盒提供）7.2对照
加50uL阴性对照血清至酶标板的A1、B1孔。加50uL阳性对照血清至酶标板的A2、B2孔。7.3加样
在酶标板的其他相应孔中各加入50已稀释好的被检样品。7.4感作
将酶标板封膜后，在振荡器上混合1min后，置2℃～8℃下过夜感作（14h～18h）或37℃下感作3h。
7.5洗涤
弃掉各孔的液体，每孔加人250μL～300uL已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤5次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，以去除孔内剩余的液体，7.6加酶标结合物
每孔加人100μL辣根过氧化物酶（HRP)标记的牛抗鼠抗体。7.7感作和洗涤
将酶标板封膜后，置室温下.感作30min。重复7.5洗涤。7.8加底物
每孔加人100μLTMB底物溶液。
7.9感作
将酶标板置20℃～25℃下黑暗处感作10min，从加完第一孔开始计时。7.10加终止液
每孔加100μL终止液，终止颜色反应。测定吸光值（OD）
酶标仪以空气作为空白对照，于15min内，在450nm波长下测量和记录样品和对照的OD值。8试验有效性原则
只有在阳性对照孔所得的平均值（PCX)减去阴性对照孔所得的平均值（NCX)大于0.15.且阴性对照孔所得的平均值应小于0.2时，测定结果才有效。9结果计算和判定
9.1结果计算
按式（1）、式（2）、式（3)计算结果ODAI+ODBI
式中：
阴性对照血清孔OD值的平均值；-A1孔阴性对照血清的OD值；
-B1孔阴性对照血清的OD值。
.（1)
SN/T1999—2007
ODA2+OD起
式中：
阳性对照血清孔OD值的平均值；ODA2
A2孔阳性对照血清的OD值；
式中：
B2孔阳性对照血清的OD值。
样品孔的OD值。
9.2结果判定
OD-NCX
PCX-NCX
如果S/P值小于0.20，样品判为牛病毒性腹泻-粘膜病阴性。·（2)
.·（3)
如果S/P值介于0.20和0.30之间，样品判为牛病毒性腹泻-粘膜病可疑，应重新检测；重新检测仍为可疑则判为阳性。
如果S/P值大于等于0.30，样品判为牛病毒性腹泻-粘膜病阳性书号：155066·2-18459
SN/T 1999-2007
定价：
2002—6661/
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