【国家标准(GB)】 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通 RT-PCR方法和实时荧光 RT-PCR方法

数码防伪
JCS 67. 10G
YKAONKAca
quE-ei-aC-eC-ae-Ciaac-CEC-Nca-iikAoNiKApaG
中华人民共和国国家标准
GB/T 22287--2008
贝类中甲型肝炎病毒检测方法
普通RT--PCR方法和
实时荧光RT--PCR方法
Detection or hepatitis a virus in shellfish-Contentional RT-PCR and real-time fluorescerice RTPCR2008-08-12发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会Www.bzxZ.net
2008-12-01实施
本标难的附录A为规范性附录
本标摧出国家认证认可监督理委员会提出并归口：YKAONKAca
quE-i-ac-ec-ae-Ceraac-CEc-Neca-rikAoNiKAraGR/T 22287-2008
本标唯起草单位;中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局
本标滩让安起草人：陈广全、饶红、段洪安、冯塞、付溥博,张矮，注齿、曾静、张蓉,李金华，1范围
贝类中甲型肝炎病毒检测方法
普通 RT一PCR 方法和
实时荧光RT一PCR方法
YTKAONKAca
qUE-ei-aC-eC-ae-Ceraac-CEC-Neca-iniKAoNrKAaGB/T 22287—7008
本标准规定了贝类中甲型肝-炎病毒的普避RTPCR和荧光RTPCR检测方祛。本标准遥用」贝类中甲型肥炎病虑核酸的检测。2规范性引用文件
下列文样中的条款过适本准的引用而成为本标雅的条款。凡是注几期的引用文件，其后所有的修改单（不包括划误的内容)或髂订版均不适用上木标温，然而，鼓动根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本，凡是不注口期的引用文件,共最新版在适用了本标准，GB/T 6682分析实验室H水规格和式验方法(G1/T 66822608,1SO3685:J987.M(0D）GB19189实验穿生物安全通防要求SN/113基制分机放测实验室技术求3术语和定义
下列术语和定义适润本标准。
合酶链式友应pulymerase chain reaction,PCRJNA模板先经高温变归为单链,在适的温度下和缓冲液中,两条引物分弱与模板[NA两条链上的段互补序列发生退火，接者在A聚合酶的催化下以四外TP为底物，使退火引物得以处仰，如此反复变性退火和延伸，使位于两段引物序列之间的DVA升段早几何倍数扩增，3.2
反转录-聚合酶链式反应
reverse transcription polymerase chain rtaclion, RT-PCRRNA在逆转录酶的作用下，适宜反应条件下，敲逆转录成rL)NA.以1NA作为模极进行PCR3.3
实时菱光 RT一F(Rreal-time fluorescence RT一rCR实时荧光RTPCR方法是在常规RTFCR的其础上，加入-·条特异性的荧光探针。该操针为-段寰核若酸，两端分别标记一个报告炭光基团利一个淬灭荧光基团，深完整时,服告基团发射的荧光信号被卒灭基吸收;PCR扩增时，T&q酶的5\-3外切酶活性将探钙切降解，使报告荧光禁团利滚火光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增条I)NA链-就有一个龚光分于形，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完个间步3.4
cytlethreshold
个反应管内的装光信导达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略语适用于本标推。
GB/T 22287—2008
4.1HAV.甲中型肝炭病毒，
YTKAONKAca
quE-i-aC-eC-ae-Craac-CEC-Nca-iiKAoNrKApa4.2TCID维织培养卡数感染量，足病与感染半组织细跑时的病毒稀释度，-般使用RHdMuenth方法计算。
5试剂
除有特殊说固外，所有实验用试剂均为分折纯；实验川水跨为云离水，既格符合GB/T6532相关规定。
5.1廿氮酸缓冲液，见附录A中的A.1.15.2PG8000 降液:见附录 A 中的A.1.2，5.3裂能液：Trivi-1或其他等效产品：5.4Poly(dt)磁珠:Lynalbcadaligo(dt)25 或提仙等效产品。注：给出这一信息是了方他本标雅使用者,并不卡示对该产品的认可。如果其他等效产晶甚有相向的效果,则可使用这些等效产品
5.51×RNA吸附缀冲液：见附录A中的A,2.5。5.62×RNA吸际缓液：见附录A中的A.2.6。5.7洗涤缓洲液：见附录A中的A.2.7。5.8QIAannpVialRNAMiriKit（Qiagen529031)或其他等效产lt。5.9 Supt:rscrip:-d une-steu KT PCR with platinutn Tayj (Invitrogen Cat. Na. 10928-03:) $ Hitl等效产
5.10Suprrseriptmfirx1-strase! syhthesis system forRT-PCR(Invitoger:Ca,Na,s0so-05J)\其他等效产品。
5.11Ltuiversr)PCRMasterMix(ABI43C4437)或其他等效产品。5. 12 萨延 RT PCR检谢引物序列(5°- 3\)正义引物(No. P1)
反义引物（No.P2)
CAGGACATAGAAAGGTGAG
CTCCAGAATCATCTCCAAC
引i物位于HAV基因组中缩码VP1VP3充蛋白的区城，目的片段长度为192bp元RVaHe的去离子水配成100umol/L储各液5.13实时荧光RTPCR检测的引物和探引物或操针序列（5，3\2
正义引物AV)
反义引物(HAV2)
反义引物(HAV3)
TTTCCGGAGCCCCTCTTG
AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC
AAAGGGAAAATTTAGCCTAIAGCC
FAM-ACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCTTAMRA加元RNase的去离子水配制成1cc μma!/l.储备液，5. 14 LNA 分于量标记,100 bF-2 0(U bp:5. 1550× TAF或其他等效缓冲液:见附录 A 4的 A,1. 3,5. 1610× 上样绥冲滋:见附录A f的 A.[. 65.17甲肝减毒活疫苗：作为阳性对照添加半已知的阴性贝类样品中剑成叫性质控样品。5.18三象烧：每次使用时注意防止Rmr.5污染，异丙醇，每欲使用时注意防止Rrasc污势，5.19
1）给出这信息是为为使本标能使用者·并不表示刘该产品的认可，如果其他等效“品具存相同的效果，则司使川设世等效产品。
5.2075%乙醇:见附录 A 中的 A. 2. 4.5.21无RNasc的去离子水：见附录A中的A.2.35.22漠化乙键(10 μg/μL):见附录A中的A.1.4、5.23焦碳酸乙酯。
仪器与设备
6. 1组织匀器(0 r/min~20 c00 r/min)。6.2PCR仪(FE9609 或其他等效设备）。6.3实时荧光PCR仪（AB17000或其他等效设备）6.4凝胶成像系统，
6.5恒温水浴(1℃.95 )。
6,6旋混匀器（20℃ t/min-2 50c r/mi)6.7 电泳仪(0 V--300 V)。
6.8酸度计（0~14.00H.最小显示单位0.01H,1mV)。6.g高速冷冻离心机(Meckinan model J2-21 或其他等效设备）。YKAONKAca
qUE-ei-aC-eC-ae-Cenaac-CEC-Nca-niKAoNrKAaGB/T 22287--2008
6, 10 微量加样 器 (0. 1 μl..~2 μl..1 μl.- 10 μL,20 μl. ~100 [L.100 μ].-~ 1 C3 μL,1 000 μl. -- 0u μL)。
避温泳箱一8)
费滤心的无Rras的微量加样器吸头（10l..leoμL20cl..ml.)。元RNast的离心管和PCK友应管20pl..1.5m.2ml).6.74
磁力搅拌器
615电子天（最小精度值.01），7
样品处理
7.1样品的运输与保存
样品至少成企1“以下的环境中进行运输，实验室接判样品启应尽快送行检测，如果暂时不能检测应将样品保存于8%冰箱中，
7.2取样
用灭菌蒸馏水将贝光表面的污泌清洗十净，打开贝充后，倒掉腔内的液体，使用灭菊消毒的剪刀对产收贝的消化道组织10。
8病毒的富集
10g贝类消化道组织中加人70Ⅱ山甘酸缓冲液（样品质量与缓冲液休积之比为1：7）.组织与浆器中充分破碎混匀2min。取出勾浆液30ml，置37孵育39mn：」4℃150c0g：离心20n:in收集上清液，加人等休积三氟印烧，闪能混匀1mit，室温放置5mi，1700g，1℃离心30in，从t层液相出15nL上清液，加人等体积的PEC8900落波（PEG终浓度为6%），于1C过夜沉降病声10000g：4“C.离心min。弃上消，保留沉淀，选择下列谢种方法之一进行尺NA超，9 病毒 RNA 提取
9.1硅胶膜法
向沉淀中加人 mal/L的异硫鼠酸胍溶液ml.尽量使淀充分落解，涡能混勾·使用Qiagn的QIAampViralRNAMinKit成其他等效产品进行RNA提收，按照厂家的试剂盒使用说明进行操作。
GR/T 22287--2008
9.2磁珠法
YKAONKAca-
quE-i-aC-eC-ae-Craac-CEC-Nca-iiKAoNrKApa于沉淀中加人 ml Trizoi regent，满就混勾@次充分溶解。4 放置1 h移至l mL或[5 ml. 的离心曾中,加l人 1,2 mL 三氯甲烷,剧烈涡旋混均1 min,室温放置5 nin。4 “C,12 o0ug 离心 rrin,取上清液。则人 n.5倍体积异内醇,室温放置 trir。4 ,5 0g 离心 10 tmin，弃上清液,用75关乙尊(4）洗染沉淀：11693g：4C,离心13 n1n，充1清液,倒置于吸水纸F,尽量吸F液体3 0c0g,1℃,离心l0 s,将管壁上的残余波体展到管底,用微轻加非器尽故将片吸十,冰F:1媒5mim~10 r:in用30nul.无RNA酶的水意悬沉旋，加热至 90 亡,涡旋混勾使沉凝溶解，按照 Dyralhcadsolig(d1)25或其件等效产品使用说明进行RNA纯化。9. 3RNA的保存
制备好的RNA应尽快进行反转录，若驾时不能行反转录，成于，80七保存备用：10核酸扩增
10. 1普通 RT--PCR 方法
10. 1. 1 Supersctipt\ onc-step RT PCR with platirum Taq (Invitrogen)r法:RT PCR 在 -个l应体系中一次究成，反应体条包含：2×反应混合物
:义引物(N. PU)( pnol/μL)
反义引物(No.P2）（10 pmol/μL)酶混合物
25 μL
20 μL
反应条件:50 ℃,30 mir;94 ,2 min。 变性(94 C,3 min)。 91 ℃.1 mia,49 ,1 -nin 20 s, c,i tnin,tc 个循环;延伸2 ,10 min),注：正使而其低等效的--步法或两步法RT一PR 检测试剂点进行,反应体系浓,变和反条件可应调。10.1. 2晾脂瞻凝胶电泳检测增产物用1×电泳缓冲液配制1. 5头的琼脂糖凝胶。在电泳槽中加人电泳缓冲液,负液面剂刚没过避腔，将 10 rL PCR 增产物分别与适些加样缓冲液混合·点样。5 V/cm忆JK、电泳 20 Fil：凝胶成像仪 下鸡察中泳结果，拍照并记录结果10.1.3阳性产=物的确认
0.1.3.7在阴,阳对照闯成的前提下，果扩增出与的片段大小符的扩增条猎，可初步判断为RTPCR增H性，将PCR产物月快速纯化试剂盒纯化后，连接质粒后进行测序，并与(icne:Bank数据库中的序列进行比对。
10.1.3.2使用10.2方法进行检测和确认，10. 2 实时荧光RT—CR 方法
10.2.1反转录反应
雕机引物（1 pmol/l)
无RVasc的去离了水
L述混合物于6 呼育 5 t:iin,效于冰11 mi后,加人下列反应混合物：10×缓冲液
氯化镁(MgCl）
Rnaat: aln.
反转录
反转录反底条件:42 ℃,30 min,75 芒,15 min,4 ℃10. 2. 2实时荧光 PCR 反应体系2 X FCR 反应缓冲泌
反义引物(HAV2 和HAV3 均 1G pIrol/μL)义物(IAV)（pol/p)
探针(10[:l/1.)
划火菌去离子水牵
实时炭光RTPCR反应参数：
YTKAONKAca-
qUE-ei-aC-eC-ae-Ceraac-CEC-Neca-iniKAoNrKAa(B/T 22287—2008
4. 5 uL (HAV2 利 HAV3 等体积.共 4. 5 μL)4.5μL
50 C,2 nin;95 ℃,10 min;95 ℃.15 s,69 ℃,1 rmin,E6 个循环.注：可用其也等效的-步法或两步法RT…PCR呛别远剂余进行,反应体系浓官和反敲条件明做相应调录，11质量控制
11.1性对照：将100个111)的甲肝疫苗添加于10g已知的断性贝类消化道组织中，与待验样品进行相同的处理。陷性对照的日的是试样品坤的核酸是否被有效的提最出来，如果阳性对照出现阴性给果，说明纳毒RNA提取失败应重新对品升得检测11.2阴性对照：取已的阴性页类消化道组织10名，与得检样品进行相间的处理。若阴性对照出现忙结果，可能足试剂.反应体系有污染，应查找原因，重新进行检。11. 3试剂空白对照过行普通 PCR及实时荧光 PLR 需设立试剂对照，以检测 PCR 反量混合物中是否存在污染。若试剂空白对照山现阳性结果，应更换试剂鹿重新进行检测。12结果判断及表述
12.1结果判断
12.1. 1普通 RT—PCK方法
12. 1. 1. 1对待测样品进行 RTPCR检测,如果阴性对照和空白对照术出现条带，阳性对照所现颅期人小的扩增条带，而样品荣出现预期人小的扩塔条带，则可判定样品可型肝炎病核般检测闭性。12.1.1.2如果阳性对照利空白对照未出现条带，阳性对照利样品出现顾期人小的扩增条带，并H对R产物序列分析证实与甲型肝炎病毒序列一致，则可判断样品型肝炎病毒核酸检测阿性：若两名序列不致,则可判断样品甲型肝炎病肯核羧检测阿性12. 1. 2 实时荧光 RT—PCR 方法待检样品的（t值13时，则判断为中塑并炎瑞毒核酸检测阴性。待检样品的（t值经40 时卿判断为甲型肝炎病毒核腰检测阳性待检样品的40C1值≤13时，应五新进行检测，若五新检测的Ct值243时则判断中型炎病毒该酸检测阴性，若重新检测的4C值心43时,则判断型肝炎病毒核酸检测H性。12.2结果表述
甲型肝炎病毒核酸检测阳性/肠道组织。平型肝炎病涤核酸检测明性5 g肠近组织。13安全
13.1实验室安全防护按（B10489中的规定执行，13. 2实验中使用的焦碳酸二Z.脂,腺化乙锭其有荐致癌作,应戴乳胶或PE下套进行操作，焦碳较一心
GB/T 22287—2008
TKAONKAca
qtE-ei-ac-ec-ae-Ceraac-cc-nca-iikAoNhrKAa乙酷具有挥发性,应在道风橱或通风良好的坏境中配制和使用;所有使用过的器:Ⅲ应于 121 %产压3iti再进行消洗。Trizulregcn1对皮肤只有极强的离蚀性，碟作时应囊乳胶乎套。13.3实验中产生的废奔物和器趾（除配制焦碳酸二乙酷的器二外)应于121℃高压20inin后再玉弃或进行清洗，
13.4操作一氯印烷、异内醇时应谢戴次性于套并在通风橱或通风良好的环境中配制和使用。14
防污染措施
检测过程中防污染措随按照S/T1193中的规定执行。A.1普通溶液的配制
附录A
（范性附录）
溶液的配制
A, 1. 1 甘氨酸缓泌被:含 0, 1 mol/L 针氨酸,0. 3 mal/L NaCl.μH9, 5甘氨酸（优级纯）
飘化钠(NaCi)
去离子水
5Enl/L氧氧化钠溶液(NaOH)
调 pH 至 9. 5
YKAONKAca
quE-ei-aC-eC-ae-Craac-CEC-Neca-iikAoNrKpaGB/T 222872008
加去离了水至1000 mL,12i°,15 rin灭菌用：此淬液可于4℃保存9个片。A.1.2PFG8090 落毅:含 16(质量浓度)PEG 8C00,0.525 mal:I.NaC:PEG 5C0心（统缎纯）
化钠(Nan)
加去离「水至100 r:L，于磁力搅拌器上混勺后，121℃,15 mir:火菌各。此溶波4 （.保存个厅。
A 1.3微TAH缔:
A.1.3.10.5 mul/LEI)TA-Na(乙二铵四Z酸二钠)案液·pH8.αHTA Na,H,)
灭菌长离子水
：mol/l.氢氧化钩鞍綫
800 mL
调 pH 至 8. 0
火荫夫离于水灿至1 60 l121 ,1 tnr火菌备用。A.1.3.2IAE电脉缓外液(5(×)配制羟脂中基销甲烷【Ti
冰艺酸
0. 5 mo1/1, EDTA溶液,pI18. 0242g
109 mL
火带离子水加至1 009 m,121（,1i灭菌备用用时用灭菊去离了水稀释至I×使闻。A. 1. 4溴化Z锭(FB)(1G μg/μL)溴化乙锭
灭荫去子水
A. 1. 5含 0. R H/i1. 激化7键的 1. FY琼脂糖避胶的配制琼皆链
1×.TAF电泳缓冲液
混合后加茄至究金融化：待冷至5G~55℃时·加溴化乙锭（EB)溶液5μI，轻轻匙动播勺.避垒严牛气泡将梳子箐人电冰糖中，然后将琼脂森溶液倒人电泳披F，待凝剂所露约1Cm），下梳子备用。
A.1.6×加样缓冲液：
灭菌离了水
溴翻蓝
GB/T 22287—2008
一中苯青
A.2RNase 的去除和无 RNase溶液的配制0.1g
YKAONKAca
quE-ei-aC-eC-ae-Craac-CEC-Neca-iikAoNrKApa配置率液用的酒精、异丙静、Tris，EDTALiCI.NeOH等应采用未开封的新品，配制溶液所用的去离了水玻璃穿器微量划样器吸头，药等塑料用其应无RNaS。摄作过程中应白始至终戴次性橡胶或乳胶手套-准经常史换，以游免将皮肤上的细菌和真菌以及人依白忘分泌的RNA酶污染用具或帐人溶液。
A.2.1玻璃容器应在240烘烤4h以去除RNasCA.2.2离心管，微量加样器吸头、药勺等塑料用具应用0.1的DEPC（焦炭酸乙酯）水室温浸泡过夜，然后火菌，烘十；或占接购头无RNasc的相应规格离心管、微量加样器吸头。A. 2.3无 RNa5l:去离了水
去离子水
焦碳酸一乙酯(DEPC)
loc nl
室温过夜，121℃，15min火菌，或占接购买无RNasc太离了水。A.2.475%乙醇
无水7.醇
: RNasc 离丁水
现用现配
A.2.51xRNA级附缓冲液?Tris,LiC,EDTA-Na·H.O为优级纯）A. 2. 5. 11 mol/1. ris H(l nH7. :Tris
死 RN2离了水
36.5不盐酸
0. 7h ml.
调H 至 7. 5
加尤RNase去离水至1cm[，分装到l.nL无RNasc离心管中，一20保存，A. 2. 5. 2 0- 2mo/I F)TA Ni.(乙..绥四2.峻二钠).PH7. 5FIYTA-Naz·H,O
J: RNasc 离了水
15incl/l.微氧化钠溶液
调 pH 至 7. 5
加无RVase去离了水至ICm[，分装到l.rnt.无RNase离心管中，一20℃保存，A.2. 5. 35 mol/1. I.iCl
无RV去离子水
加无RNase去离了水至ICmL.分装到l.ml.无RNsc离心管中，一20C保A. 2. 5. 4: X RNA 吸附缓泌: 含 20 mol/E. Trin-HCI (pH 7. 5),1. :ol/L LiCl, 2 mmo]/LEIITA N+pH 7. 5
I mol/I., Tris HC!
5 l/L Lil
0. 5 mol/I. E:A Na(pH 7, 5)
无RN去离子水
总体积
现配现用，
2G0 μL
2 000 μ
7760 μL
A.2.62XRNA 吸附缓液（i,1icl,ETA Ni·H为优级纯)：含4o mol/.Tris-HCl(μH 7. 5),2. 心 mol/. 1iCI,4 mmol/l. HI)[A-Na+pII 7.5I noi/l.Tris Hci
5 mal/L Litci
C. 5 moi/I. EDTA-Na(pH 7, 5)无RNas去离--水
总体积
既配现用。
4000mL
5 52C μL
IYTKAON KAca
quE-ei-ac-eC-ae-Ceraac-cEc-Neca-iikAoNarKpaGB/T 22287—2008
A,2.7 洗涤缓冲液(Trix,Li:I,E)TA-N I1,() 优级):含 1) mro/L Ttis-Il5 mol/l. Lit!
o. 5 mol/L FDr'A Naz(μH r. 5)光 RNese: 去离f水
总体积
现配现用，
GB/I 22287—2008
参考文献
KAONKACa
qtE-ei-ac-eC-ae-Ceraac-cEc-Neca-irikAoNirKAea-J] Costa Mattinli, M. ,ct el. (2oc2). Quaniliration entl duralin pl viratr:tia alutig hepatitisA infectiori as deterruinetd by rea'-titne R'T PcR. J. Viral Hepatitis, :lcl los.2] Loisy, F., et al. (20o5). Rcal-time RT PCR for norovirus acrecniag in sheilfish, J. Virulogical Method:, 123: 1 7.
[3]C:istina Ribao, ct al. (2co4). Asecment ul dillertil coneia. RNA-exrrt:tian arR'T PtR kils lor deleclion cl hrpntitis A Virus in mussel tissues. J. Virological Methods. Il5: I77-182.
[4 Narzyanar Juthikimar el al. (20o5), Rupid unl sensinivt tlelriio:t ol Norovirtscs bynsing TagMan-hasr:d (One: Step Reversc Transcription-- PCR assays ejd uppliealin lo alurslly tonluninaied shellish sunlur. Appl. Enviran, Micrnbin! Apr: 1870 18?5.[5. Y. -S. Carol shich ,ct al. (luus)A mcthod to deteet luw 'evels of emleric viruses iu tontaminutedoystersj.Appl.Envirur,Misrobio..7o9.4?14.[6]Alissa B,Dix,Lec-ann Jaykus.(19g8).Virior ronccntration reihul lorthe: deltu:tiouafhum.ll eneric: virusts in txlsarin nf l:d sielled clans. J, Fooc F'rcotection. 4:458-155.1c
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。