【国家标准(GB)】 猪链球菌2型PCR定型检测技术

ICS 07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T19915.3--2005
猪链球菌2型PCR定型检测技术
Method for detection Streptococcus suis type 2 by PCR2005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2005-11-01实施
GB/T19915.3---2005
猪链球菌病是链球菌媽中猪源链球菌引致的猪链球菌病的总称，其病原主要有猪链球菌2型和马链球菌兽接亚种。猪链球菌2型可引起猪败血症、脑膜炭等。人可通过伤口感架该菌，并导致死亡。为控制和预防该菌引致的猪链球菌病，建立快速、特异、敏感的捡测方法是当务之急。本标雅是采用公认的细菌学诊断的现代分子生物学技术制定的。本标准的附录A是规范性附录。
本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标崔起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：陆承平、范红结、姚火春、何孔旺。1范围
猪链球菌2型PCR定型检测技术
本标准规定广猪链球菌2型的PCR的定型方法。本标谁适用于出猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检诞和定型。2规范性引用文件
GB/T19915.3-—2005
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡注甘期的引用文件，其随后所有的修单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标推，然而，鼓励板据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注H期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GI3/T6682-—1992分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准，3.1
猎链球菌2型 Streptococcus suis type 2猪链球菌是属于链球菌属的-种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个血清型，猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜转患病病原菌。4测定方法
4.1方法提要
挑取可疑细菌培养物菌落加入PCR反应管中，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电沫检测PCR产物，与标准分子量标记比较，确定扩增产物的大小4. 2试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符含GB/T6682一1992的灭菌双蒸水。4.2.1猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物。4,2. 2Tag DNA 聚合酶。
4.2. 3琼脂糖;电泳级。
4.2.4浪化乙锭。
4.2.5分子量标记：DL-2000。
4,2. 6 TE 缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8. 0),4.2.710× PCR 缓液 : 100 mmal/1. KCl,160 mmol/L4.2.9加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%煎糖4.2.10英膜基因PCR引物和英膜基因套式PCR引物。4.2.11阳性对照和阴性对照。
wiGB/T19915.3—2005
4.3仪器和设备wwW.bzxz.Net
4.3.1离心机。
4.3.2DNA热循环仪。
4.3.3核酸电泳议。
4.3. 4 pH计,
4.3.5移液器：10uI、20μl、100μ、1000μI。4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.4英膜基因PCR操作步骤
4. 4. 1 FCR 扩增
用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落玺含有猪链球菌 2型定型 PCR皮应混合物的 PCR管中,混,加入 Tαg 酶(5 U/μL)0,5 μL,2000 r/mit 离心10 8,立即进行 PCR扩增，同时设阳性对照和阴性对照。扩增条件为:95℃预变性3min,95℃20 ，55℃30 s，72℃40 s,30个循环72℃延伸7min，4℃保存。
4. 4.2PCR 产物回收
按SangongPCR产物回收试剂盒说明书进行4.4.2.1在25μLPCR产物中加人100μL结合缓冲液Ⅱ（bindingbuffer），混勾。4.4.2.2将混合物转移到2mL收集管内的UNIQ-10柱中，室放置2min，12000g室温离心1 tin。
4.4.2.3倒掉收策管中废液，将UNIQ-10柱放置同一个收集管中，加人250μL洗液（washsolutian），12000g室温离心1min。
4.4.2.4倒掉收集普中废液，重复步骤4.4.2.3一次。4.4.2.5取下UNIQ-10柱.倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放人同个收集管中，12000g源离心lmin。
4.4.2.6将UNIQ-10柱放入一报新的1.5mL微量离心管中，在柱子膜中央加12μL洗脱缓冲液(chutionbuffer）,37℃放置2min。4.4.2.712000g室温离心1min+收集回收液。4.4.3醇切
0.5ml,Epcndoff管中依次加人：DNA(PCR 回收产物）8.0μI.
10xbuffer
混勾.37℃酶切2h
4.4.4琼脂糖凝胶电泳
在电冰缓冲液中加入1%琼脂糖、加热融化后加人溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8=L酶切产物加入2μL5×上样缓冲液，混勾后加人上样孔，80V恒压电泳20tnin，紫外线透射检测。4.4.5检测猪链球菌2型美膜基因的套式PCR用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物的PCR管中，混匀，加人Tag醇（5U/L）1.0L，2000zmin离心108立即进行PCR扩增。扩增条件为：95℃预变性3min95℃40s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。5结果及判断
5. 1试验结果成立条件
阳性对照经英膜基因PCR扩增产物酶划后出现164bp和223bp两条条带后，阳性对照经套式GB/T19915.3--2005
PCR出现178bP及387bp两条条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带，试验结果成立，否测，结果不成立。
5.2结巢判断
在试验结果成立的前提下，姐果样品中英膜基因PCR产物酶切后出现164bP和223bP两条条带，或套式PCR出现178bp及387bp两条条带，表明猪链球薄2型英膜基因阳性，再结合液体培养出现短链的特性，可确诊为猪链球菌2型。6度弃物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物，应收集后高压灭菌处理。GB/T19915.32005
附录A
（规范性附录）
猪链球2型快速检测程产
猪链球菌2型快速检测程序见图A。1。可贬菌落
柯收387bp片段、酶切、电冰
出现164 bp、223 bp片段
套式 PCK
函现 178 bp、3FT bp片段
结果判断： 分离南为指链球面 2 型摔A1
猪球菌2型快速检程序
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