【国家标准(GB)】 猪链球菌2型多重PCR检测方法

ICS 07. 100. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T 19915.52005
猪链球菌2型多重PCR检测方法
Protocol of multiplex PCR identification of Stre ptococcus suis type 22005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
com2005-11-01实施
本标准的附录 A 为规范性附录。本标准由国家标准化管理委员会提出。前
本标准由全国动物防疫标化技术委员会归口。本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草GB/T19915.5-—2005
本标准主要起草人：韩雪清、林祥梅、吴绍强、刘建、贾广乐、梅琳、陈国强、张散友、姜焱、唐泰山。本标准为首次发布。
1范围
猪链球菌 2 型多重 PCR检测方法本标准规定了猪链球菌2型多重FCR检测的现作方法。GB/T 19915.5—2005
本标维适用于检测生猪拭子，增菌培养物、疑似痛料及猪组织样品（猪琳巴结，扁桃体、肉品等）中的猪源链球菌及猪链球菌 2型。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓慰根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准，GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3. 1
猪链球菌2型Srreptococcus suis type 2猪链球菌是属于链球菌展的一种细菌,根据其葵膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2 共35个班清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种重要的人畜共患病病原菌。3.2
多重聚合酶链式反应（多置 PCR）multiplex poiymerase chain reaction多重 FCR文称多重引物PCR或复合PCR,它是在间 PCR反应体系中加上两对以上引物,同时扩增出率个核酸片断的 PCR反应。4缩略话
本标准采用下列缩略语：
5试剂和材料
合酶链式反应
脱氧核糖核酸
脱氧核酸三磷酸
碱基对
除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682·1992的灭菌双蒸水或超纯水。5.1猪链球菌2型多重PCR反碰混合钩PCR缓冲液（含Mg+），2μLdNTP,1.6μ引物1.0.6μ引物2.0.6L引物30.6μL引物4.0. 6 μL:菌液 1. 5 μL;酶 0. 2 μL.;水 12. 3 μI.; 总体积 20 μl-5. 2 Tuq INA 聚合酶
5.310×PCR缓冲液
100 mmol/L KCl, 160 mmol/L (NH.),SO, 20 mmol/L MgSO, 200 mmol/L Tris-HCl：comGB/T 19915.5-—2005
(pH8. 8), 1% Triton X-100, lmg/ml. BSA.5.4dNTP混合液(各2.5mmol/I.)Www.bzxZ.net
5.5琼脂糖：电泳级
5.6溴化乙锭
5.7DNA分子量标准
5.8TE缓冲液
10 mmol/L. Tris-HCl(pH8, 0),1 mmol/1. EDTA.5.9核酸电泳缓冲液
Tris碱242g，冰乙酸57.1mL,0.5mol/I.EDTA100mL，加蒸增水至1000mL，使用时10倍稀释。
5.10电泳加样缓冲液
0.25%溴酚蓝，40%糖。
5.11样品对照
猪链球菌 2 型菌 DNA 提取物分别作为阳性对照,马链球菌鲁疫亚种 DNA 提取物为阴性对照。6仪器和设备
6。1台式冷冻高速离心机(>13 000 1/min)。6.2DNA 热循环仪。
6.3核酸电泳仪和水平电泳槽。
6.4凝胶成像系统（或紫外透射仪)。6.5可调移液器-套:10 μL 20 μL,200 μL 和 1 000 μL。6.6恒温水浴箱。
7操作方法
7.1方法概要
取培养菌液或从组织中提取的基因组 DNA 作为模板，加人到扩增猪链球菌和猪链球菌 2 型的PCR反应混合液中，进行PCR增，或直接将待检细菌培养进行PCR扩增。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与DNA标准分子量进行比较，来确定扩增产物的大小，在此基础上判定样品的检测结果。
7.2样品采集
在实验室生物安全拒中操作，将采集的组织样本测除包膜和其他结缔组织，选取内部实质部分，冻存于一20℃备用。
7.3组织样本DNA的制备
来用商品化的继织基因组TDNA取试剂盒，按说朗书进行操作。7. 4多重 PCR 扩
将培养的细菌纯培养物样品(不经过离心)1.2 μL、或者将制备的各样品 DNA以及阳性和阴性对照DNA各1.5风分别加入到含有猪链球菌2型菌的PCR反应混合液的相应PCR反应管中[缓冲液(含Mg+）,2μL,dNTP,1.6μL+引物1,0.6μL物2,0.6μL,物3,0,6μL,引物4,0.6μL;酶0.2μL，加水至总体积20μL],2000r/min离心10s，加人Taq酶(5U/μL)0.2μL,2000r/min离心10 s,采用DNA热循环仪立即进行PCR扩增。PCR扩增条件;94℃ 7 min;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,40 个循环;72℃ 10 min。扩增反应结：com束后,取出放置于4℃。
7.5多重PCR扩增产物的电泳检融GB/T 19915.5—2005
称取2. 0g琼脂糖加人100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加人适的溴化乙锭(0.5 μg/mL),然后制成凝胶板。在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。 取 5 uL~10 μLPCR扩增产物分别和适盘加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9 V/cm 恒压下电泳 30 min ~35min。将电泳好的凝胶放到紫外透射仪或凝胶成像系统上观察结果，进行判定并做好试验记录8缩果判定
8.1试验结果成立条件
猪链球菌 2 型阳性对照的 PCR 产物,经电泳后在 305 bp 和 460 bp 位置同时出现特异性条带,同时阴性对照PCR产物电泳后没有征何条带，则检测试验结果成立，否则结果不成立。8.2阳性判定
在试验结果成立的前提下，如果样品中PCR产物电后在305bp和460bp的位置上同时出现特异性条带,判定为猪链球菌2型检测阳性;若305bp位置出现特异条带而460 bp位置无特异条带,判定为猪源链球菌阳性，但不是2型菌。8.3阴性判定
如果在305 bp和460 bp的位置上均未出现特异性条带,判定为猪链球菌检测阴性。GB/T19915.5—2005
A. 1样品处理和 DNA 制备
（规范性附录）
检测过程中防止交叉污缺的摘施样品处理过程中，应防止不同样本之间的交叉污染，特别避免避过器具、手套、移薇器等的污染。A.2PCR 检测过程
A.2. 1 实验前后,要把超净工作台的紫外灯打开,以破坏可能残留的DNA。A,2. 2抽样和制样工具必须清洁干净,且用于试验的器直和离心管,PCR管等必须经过 121C,15 min高压灭菌后才可使用。
A, 2. 3PCR 反应液配制,模板 DNA 提取、PCR 扩增、电泳和结果观察等应分区或分室进行,实验塞运作应从洁净区到污染区单方间进行。A.2.4实验过程中，必须穿实验服，戴一次性手套，而且要及时更换。A.2.5所有的试剂、器材、仪器都应专用.不得交更使用。：com
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。