【国家标准(GB)】 猪链球菌2型三重PCR检测方法

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中华人民共和国国家标准
GB/T19915.4-2005
猪链球菌2型三重PCR检测方法
Method of detecting Streptococcus suis type 2 by triple-PCR2005-09-27发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2005-11-01实施
GB/F19915.4—2005
猪链球菌2型是链球菌属的成员，其致病菌株可致猪链球菌病，引起猪败血症、脑膜炎等。人可通过伤口感染该菌，并导致死亡，为了区别正谢猪所携带的猪链球菌2型无毒菌株与发病猪分离的致病菌株，特谢定本标难。本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的。本标推出农业部畜牧兽医局提出：本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标雄起草单位：南京农业大学。本标谁主要起草人：陆戚平，姚火春，范红结、何孔啦。1范围
猪链球菌2型=重PCR检测方法
GB/T119915.4--2005
本标准规定了猪链球菌2型英膜基因（cps2）、溶菌酶释放蛋白基因（mrp）和ur/2这三个毒力基園的三重 PCR检测技术。
本标准适用于由猪球菌2型致病基因和致病菌株的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最薪版本，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标谁。GB/T66821992分析实验室用水规格和成验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3. 1
猪链球菡 2 型 Streptnroecus suis type 2猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为1～34及1/2共35个血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是…种重要的人菌共患病病原菌。4测定方法
4.1方法提要
挑取可疑细菌培养物菌落，加人PCR反应管中，进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，与标推分子量标记比较，来确定扩增产物的大小。4.2试剂和材料
除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6582-1992的灭菌双蒸水。4.2.1cbs2、mrp和orf2的上下游引物，按合成说明书使用4. 2. 2 Ta4 DXA 聚合酶。
4.2.3琼脂糖;电泳级。
4.2.4濮化乙锭。
4.2.5分子量标记：DL-2000。
4.2.6TE缓冲液:10mmol/LIris.HCl(pH8.0),1 mmol/I.FDTA(pH 8.0).4.2.710×PCR缓冲液：100mmol/LKCl.160mmol/L(NI4).SO,20mmol/1.MgSO,.200mmnol/LTris-HCl(pH 8. 8),1% TrilanX-100, 1 mg/ml. BSA.4.2.8电泳缓冲液：242gTris碱，57.1mL冰Z酸.100mL0.5mal/T.FDTA（pH8.0)，加蒸馏水至1 000 mL.使用时10俯稀释。
4.2.9加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%薰糖，4.2.10阳性对照猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板：阴性对照马链球菌兽疫亚种ATCC35246株和金黄色葡药球菌ATCC25923株基因纽DNA模板。GB/T 19915.4—2005
4. 2. 11猪链球菌2型三重 PC:R反应混合物。4.3仪器和设备
4.3.1离心机。
4. 3. 2 DNA 热循环仪
4.3.3核酸电泳仪。
4. 3. 4 pH 诈,
4.3.5移液器:10 μI.、20 μL,100 μ.1 000 μL。4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统。4.3.7恒温水浴锅。
4. 4PCR 操作步骤
4. 4. 1 阳性对照和阴性对照 DNA 模板的掘取分别将猪链球菌2型HA9801、马链球菌兽疫亚种A'TCC3524G株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株接种于5%筷牛乖清Tocld-Hweit.肉汤培养基，37℃摇振培养18h,用革兰氏阳性细菌柱离心式基因组1)YA 小量抽提试剂盒提取 DNA 模板，一20℃保存备用。4. 4. 2PCR 扩增
用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌 2型兰重 PCR反应混合物的PCR 管中，混.加人Tag酶（2L:/μL）0.7μL.2000r/min离心105，立即进行PCR扩增：同时设去离子水的空白对照、猪链球菌2型HA9801株基因组DNA模板的阳性对照、马链球菌鲁疫亚种ATCC.35246和金黄色葡萄球菌ArCC 25923株基因组DNA模板的阴搅对照，扩增条件为:94℃预变性5min;94C30s，55℃30 .72℃40 s,30个循环;72℃延伸7min.4℃保存，4.4.3琼脂糖凝胶电泳Www.bzxZ.net
在电泳缓冲液中加人1%琼脂糖，加热融化后加人溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8ul.酶切产物加人2μI5×上样缓冲液，混勾后加人上样孔，80V恒压电泳20min，紫外线透射检测。5结果及判断
5. 1 试验结果成立条件
阳性对照 HA980]株经 PCR扩增出现约 858 hp,387 bp和 316 bp三条条带，去离子水的空占对照、马链球菌曾疫亚种ATCC35246和金黄色葡萄球菌ATC25923株基因组DNA模板的阴性对照PCR产物电泳活没有条带.试验结果戒立·否则、结果不成立。5. 2结果判断
琼脂糖凝胶电泳后，在紫外线投射下检测，在空自和阴、附性对照成立的情况下，待检样品只出现387bp一条条带、可判定为猪链球菌2型：待检样品山现约387bp，316hp和858hp三条条带，或出现337 bp和 858hp 两条条带,可判定为猪链球菌 2型致病菌株;待检样品只出现 858 hp一条条带,可判定为非猪链球菌2型的致病菌;符检摔品不出现条带，结果为阴性。6废奔物处理和防止污染的措施
检测过程中的废弃物,应收集后高压灭菌处理。
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