【商检行业标准(SN)】 动物流行性乙型脑炎微量血凝抑制试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNfT1445-2004
动物流行性乙型脑炎微量
血凝抑制试验
Micro-hemagglutination inhihition for Japanese encephalitisvirus of animals
2004-06-01发布
中华人民共利国
国家质量监督检验检接总局
2004-12-01实施
本标准的附录A是规范比附录，
办标准由同认证认可监归管理委员会提出并归口。本标准起草单位：宁毕人见夫和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起中人：李树满、胡永强、李链、徐红。本标准亲首饮发布的出人境检验检获行业标准。SN/T1445—2004
1范围
动物流行性艺脑炎微血凝抑制试验本标滤规定了微量血凝抑制试验检测动筑行性乙型脑资抗体的方运：本标泄适用于动物流行性乙型脑类的控度、流行病学设查和免疫监测。2材料
2.1.1磷氢二钠(NaIIPO,12H;0)：2.1.2磷酸:氢钠NaI,FQ:2I1,O)
2.1.3氢化的NaC）
2.1.4狗球够钳NC,H,O.+2H.0.
2.1.5恂热较H,C.O,H.0)
2.1.6面(C.H，·H.0)。
2. 1. 7政(H,BO,)。
2.28蒸氧化销（NOTT)
2. 1. 9牛土消白蛋片(BSA)。
2. 1. 10白购±
SN/T1445—2004
红细跑保存减、生理盐水PH9.潮酸盐落减（BS),.4%pH9.U牛实清亡强白感酸盐落落2.1.11
(HABS)、丝细胞橙释液、白陶士落液的配制见附录A注：所有化学试润均为分析，
2.2收器设备
2.2.196型微量反虚板，
2.2.2多通试、单通道可调移举器及加详：2.2.31UmL无菌注射器。
2.2.4离心管、
2.2.510mt.和1ml.爱.
2.2.6大半(0.0001)
2.2.7水浴锅
2.2.8通冰箱，
2.2.9恒温第.
脾度计
2.2.12咨通低迪离心乱
2.3标准试划
2. 3. 1沉行生乙型脑炎血凝素。2.3.2流行世乙型脑炎阳性主情。2.3.3流行控乙型脑炎附性而消。SN/T1445—2004
2.4试验动物
健废声年（1--16月龄）通性势
3采样
被检动物无菌采血= arL,待血获凝同后,以200G/ria离心1 min,分离血消,血清一C保在备用，
4操作方法
4.1制备弱红细胞悬液
取10ml.无菌注射器.先吸人红细胞保存凌0.5mL，以鸡的想静脉光菌采上5mL.立吓注人盗有%.T.忘红细脑保存的容举牛，不时密动,3后置4冰箱过变，次几等红细跑倒人商心管平衡后？(ot/inin离心3min，充去上错液.离心管中il入1n倍量生理款水轻轻混,200r/rrin两心5正，如此反家三次.常三夜用同样的速来离心1nmm,尽量吸志工试滴。月1r-[.双管通人离心管内红翻跑泥的山心部，及取所透的缸纸跑，用生理盐水配成8学的红细呛景溶，金下的红细鸣混1下保存备H.再分别用aH6.0.pII,2.pH5.4.PHe.6.PH5.8的红细构样般将8%的红细胞总腋作24落稀择制成0.33工准然不同H值的细瓶点液4.2处理被检应质
取血消0. 11.25%的网上0.：抵等限.置 1或1逆夜。加 9. 的B微.4iml.摇2cor/m离心33min,取上销rC系能3)min，鸥红细脑混0,m.视句，置37%恒盗笔反应 mim。15mi-离心 mim,保留工清，等沉稳，此上流波即为]=[筛择度的波控血结、
4.3测定血凝★的最适值
2,3. 1取 35引, U型微量反应拉,按表1 标记。孔加人 25μL, AS,排的第 孔人 25 μ 而豪，滤勾片夏25车第二礼牛等过格比端到数第二孔，并从倒数第二孔中吸去25产。最后不们血影素性为细胞剂膜，
4.3.2每R4BS2L充分热室温（2%--25）改量3n-63m4.3.3各排每礼分别人不同H033%工作度的红细服是较50起勺后.37就置1，剂断氧果，例见表1.
的红级
绝悬能bzxz.net
血适河定结果
血源恶的释样
1 : 15
:121:251 : :121 :1 241 : 2
注，与表天红胞亡uU说患，导一示度状，集药起均行布工轻个孔底。达2：下下1装示当跑约治凝来，孔底仍有红缩的说境吸试软，遇用形成腾状，抗3：+一本示部细甩的53不凝能.血尚周同有降集照轻，但不已膜决。 4:一农示细的约 25死逐果,肌病周闲仅有少量的既取位,信5：变示当如制心费，是滴状抗派T准，用图无疑集利粒，2
缸细临
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出表1可见该主第在pH6.4的片下凝土效价量伟，所以pH6.4定为该血疑事的最运pH值4.4测定血凝素的工作浓度
4.4.1用最适μH的红细脑尽滤或新流定血凝素效价：取9G孔U型滋草反应板，按表2标记.每孔均加人25.AS，第一孔凋人25.血素，混匀后吸25，至第孔作等量倍比萨释至例数第孔，长以倒数第二孔中大25。最后一孔不加血避素作为汇细胞不照，4.4.2每3AB525uL，充分谣至益（2c25放39min~-62min，4.4.3每孔均人FH6.40.33%红缅胞号（股道pH的红约胞基夜1501.充升搭后：37就与1 h,数断结果，学例见表2.
表2血凝索二作浓座的测定结果
直说示的得释间
: 1231: 255
1 : 512 1 : 1 024: : 2 048
红细胞对照
能与红胞随成十十”的最稀群质是为血群系一个单位IAI]表2十的血素单位为1：1C21。在避拆诚验，所的血案单位“要求在2=户含BA即1：12，4.5凝抑制试验
4. 5. 1样
4. 5. 1. 1标记反应板
取%孔型做量反应，按表标记
微量血凝抑制试险
祥马所
解价效
1 : 2u
应能对照
注1.$为邦品的义文尚可，
使2观其尚果判让金见大1注，
4.5.1.2借比捕释血请
每次试验均没网性血消、阳性血消对照。别性二标、旧性以境号样品同举烯轻12
2羊位
[单位
172年位
1单位
二8单
红知的
推品及血清对第 2--8排每孔加人 μ BABS,第 ,2 和 8排中 1--[1 引分别加人对经处型的1：10血清2自第2排开始浪寸后2L至势3请，第3排混勾没25兰第4#，如此倍比程轻率第排，第7排限勺后弃会25，血清弱推底为1：10~1：840，第9排1~11孔作为扫应的血油对需
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4.5.1.3设立血源策及红细胞对照第12列为查凝享及红细胞对照，从上在下数第2~孔每孔加人25BA第1，2孔每孔加单粒血避索25，自第孔始混勺后吸25.至常孔射3孔混匀吸2第1如此倍比稀释至带7孔,第7孔浪勺后弃关25μL。血既素相应为3HAL、4「IAU,2HAU.1HAU、1/2TIAU、1/4HAU.1/8HAU。第8孔加人25uI.HABS作为红剩跑对照，4. 5. 2 加血能紊
第1~11列除第日浸外,每孔加人HAU工作银度的血疑累25uI,第12列每孔人25LBABs.港勾后，室温（25C--25C）放置30min*60mial。4.5.3如加红细胞
每孔均加人p64,33兴工作银度的红细胞总缺10μ[.轻轻勾后7C放置15洁果判定
5.1对照
红细跑刘照科帆南激无凝集，制性对照完全联乐。性对温的血疑挥制滴理与已知滴度术得相芳个涵度以上血凝求对服表，所乐：8单位、4单位利？单位素完全凝集，1单位血凝素右颜集。1/2、1/4、-/3单位血疑系25%以下凝案：5.2检测样本判定
5.2.定方法
照成立的情况下，以够完全拆制的逆的最高帮系估教作为该血消的血能抑制护体效价。表3所示.S1的血制抗件效价为1：83.而的拍制抗达效价为1：52C.5.2.2判定标准
猪血消的血凝拆制抗车效价大于或等下1·20为流行性乙益脂炎坑体阳性丑弱一声的血舒抑制就估效价大于或等于1：40判为流行性乙型脑炎抗体阳性，附录
（规范性附录）
试别制
A.1红竭胞保存渡（Acid-eitrate-dextruse,AC)的配制氯化钠(N）
拘拨酸(NAH,O,·H.O)
构热避HC,H,O,H.O
做萄带（C,H：O·HO)
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加蒸馏水分剂离解后，定客益1000ml.，分表：115七灭虚13min.需4℃保存备用。A.2生理盐水的配制
称8.5gNac.加蒸水游解定穿率1ono)ml分装，5灭的10min，4备月，A.3pH9.C离液（beratesnlineBs的配制称0.92gTO，700m.热双谣水深露冷却定零三1C配制C.5m/的酸帘液,1℃存各用,
称40.NaH.蒸水资解店，定穿笔1000m.配剑就1.Um.c[/L氢氧化钠逆批，家温静上3 d后使用
你87.gNaCl.刘惠增水离解后，定容至-m2anl.配制成1.5mml/L款化钠样被，115灭菌10ri1,4管保本各月，
取0.：rtol/1.硼酸济敏100mL、1.0mol/氢化销弃液24mL、=.5mal/套化钠降液80ml.加蒸水定翌全100cmL.准年上成pH2.0S.4℃保存用，A，4,4%pH9,0的牛血清白蛋白动酸盐溶液(jorinealbumln/haratetaline.BARS)的配制称0.卡血清片量户,2片.C解关定弃10CmL,4保存各月A.5不同pH值磺敌距冲商(PBS)的配制A.5.10.15mat/1.氯亿纳-0.2mml/I.磷壁氢二钠（甲液1的配制氧化(NaCl
磷室然(NEP）+12I.O)
加蒸水定案笔CumL，1.5灭蜜1Oimin正4Y保行备用A.5.20.15mo)/I.氯化纳-0.2mol/，碘酸二数钠（乙液）的配Nac:
NalI.PO,2E.U
如蒸增水定雾举5cumL，1:5r灭声tomin置-保备用，A,5.3不同pI低PBS的配制
按表A.」中的比例取平滋和乙液旋合，E制成相应PII值的BS。5
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:2. 5 ml.
囊 A. 1磷酸避冲液的配制
A6不同pH佰红细胞预释液的配制PH 6.4
pH 6, 5
45, c l
55.心 uL
45.心 uL
收6.0-5.的磷酸經冲微各5L.分别人等量JS.的S匀，4%保存备用。A了白随土的配制
A.7.1D.1mol/L益酸的配制
20mL浓整酸(34%~.38%），加幕确水举1200aL.退备用。A.7.2龄洗自商士
取25自土，加蒸图水100ml币加人G.1mml/1.盐酸2m.充分摇约室温静罩1，弃上消落。沉淀蒸馏术复洗漆举中托（的15次），量后一次加蒸调水据句后2000：/mir商心19前itL，弃上液，沉淀币战璃感移至滤纸上，曾37心恒温策内莱在干持月。A,7.325%白土的配制
我25g晚选自购一.加人100ml.PE9.0的S充分裁举呢，1保存各用，
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