【地方标准】 绵羊肺腺瘤病的检测方法 PCR方法

ICS 65.020.30
备案号：36853-2013
DB15
内蒙古自治区地方标准
DB15/T536—2013
绵羊肺腺瘤病的检测方法（PCR方法）
Detection of ovine pulmonary adenocarcinosis PCR method
2013-01-20发布
内蒙古自治区质量技术监督局发布
2013-03-20实施

前言
本标准等效采用OIE相关章节Chapter 2.7.10 Ovine Pulmonary Adenocarcinoma（adenomatosis）推荐使用的方法。本标准的附录A、B为资料性附录。本标准由内蒙古出入境检验检疫局提出并负责解释。本标准起草单位：内蒙古出入境检验检疫局。本标准主要起草人：海、赵治国、赵林立、郭铁等。

1 范围
本标准规定了绵羊肺腺瘤病的PCR检测方法。本标准适用于血液及支气管肺泡灌洗（BAL）样品中绵羊肺腺瘤病的特异性检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696:1987）
GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求

3 术语和定义
3.1 聚合酶链式反应（PCR）
一种用于扩增特定DNA片段的方法。模板DNA经高温变性为单链，在引物作用下与互补序列退火，并在DNA聚合酶催化下进行延伸，通过变性—退火—延伸循环实现DNA指数扩增，一般经过25～30个循环。

3.2 DNA：deoxyribonucleic acid（脱氧核糖核酸）
3.3 Taq：Thermus aquaticus（耐热菌）相关DNA聚合酶
3.4 dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合物

4 防止交叉污染措施
按照GB/T 19495.2相关要求执行。

5 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682要求。
5.1 绵羊肺腺瘤病检测引物（序列见附录A）
5.2 生理盐水（见附录）
5.3 DNA提取试剂盒
5.4 琼脂糖
5.5 溴化乙锭（或替代染料）
5.6 分子量标准（100～2000 bp）
5.7 T缓冲液
5.8 PCR缓冲液
5.9 电泳缓冲液（见附录A）
5.10 其他实验相关试剂

6 仪器设备
PCR仪；凝胶成像分析系统或紫外分光光度计；恒温水浴锅；离心机；微量移液器（1～100 μL）；振荡器；分析天平（感量0.01 g）。

7 样品采集
7.1 血液样品
无菌采集颈静脉血约10 mL，置于抗凝管中，低温保存备用。

7.2 支气管肺泡灌洗样品（BAL）
对待检动物进行麻醉与固定，通过喉镜将导管插入气管并进入支气管，注入生理盐水后回收灌洗液，收集样品并于低温保存备用。操作过程中需更换手套及器具，避免交叉污染。

8 检验步骤
8.1 样品处理
血液及灌洗液样品按实验要求进行前处理后用于后续DNA提取及PCR扩增检测。