【农业行业标准(NY)】 猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术

ICS.11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 537--2002
猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术
Diagnostic technigues for actinobacllus pleuropneumonia2002-08-27发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部　发布
NY/T537—2002
猪放线杆菌胸膜肺炎（简称APP）又称猪接触性传染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneu-monia），是猪的一种呼吸系统重要传染病。世界各国均有发生。本病主要引起猪的一种伴有胸膜炎的出血性坏死性肺炎，多呈最急性或急性病程而迅速致死，可发生于任何年龄的猪只。尤其在集约化养猪场一且发生会造成重大经济损失。国外用于本病的血清学诊断方法有凝集反应、琼脂扩散、间接血凝、补体结合（CF)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。而最常应用的血清学诊断方法是CF和ELISA试验。细菌的鉴定除用常规方法外，也有用聚合酶链反应(PCR)方法诊断。型的鉴定常规方法有琼脂扩散和间接血凝等试验方法，近来亦有应用核糖核酸分型的试验报道。本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E、附录 F、附录 G、附录H均为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：朱士盛、杜文金、徐瑞、主新。304
1范围
猪放线杆菌胸膜肺炎诊断技术
本标准规定了猪放线杆菌胸膜肺炎的诊断技术。NY/T 537--2002
本标准酶联免疫吸附试验用于筛选试验，包括产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。补体结合试验适用于口岸进口猪检疫。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4789.28—1994食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3病原学检查
3.1材料准备
3.1.1培养基
3.1.1.1营养琼脂：按GB4789.28—1994中4.7规定配制。3.1.1.2血琼脂：按GB4789.28-1994中4.6规定配制，其中4.6.1成分用4.7.1成分代替。3.1.1.3尿素琼脂：按GB4789.28-1994中3.15规定配制。3.1.1.4巧克力琼脂：制备方法见附录A。3.1.1.5类胸膜肺炎微生物(PPLO)琼脂：制备方法见附录A。3.1.2其他材料
3.1.2.1灭菌棉拭子。
3.1.2.2革兰氏染色液：按GB4789.28—1994中2.2规定制备和染色。3.1.2.3糖发酵管：按GB4789.28-1994中3.2规定制备，3.2.1成分中蛋白改为多聚蛋白陈，pH调至7.2，另外，按0.5%加人糖的同时，按0.01%加入辅酶A后，分装于有倒置小管的试管内，68.94kPa(115℃蒸汽）灭菌15min。3.1.2.4鸡表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。3. 2病料采集
3.2.1活体病料采集：用棉拭子伸人鼻腔采集分泌物，放入无菌试管中立即送往实验室供分离。3.2.2死后病料采集：无菌采集具有典型病变的肺气管、肺门淋巴结、鼻腔分泌物，在最急性感染死亡的小猪，除采集上述病料外，还可取肝、脾病料。3.2.3样品运送：采集的样品，应在4℃条件下24h内送到实验室。3.3病原分离
将样品按常规分离要求直接接种到血琼脂（见3.1.1.2)表面，再用鸡表皮葡萄球菌作交叉划线，于37C含5%～10%二氧化碳（CO2）下培养。继代培养用巧克力琼脂（见第A.1章）和PPLO琼脂（见第A.2章)。
NY/T 537.--2002
3.4病原鉴定
3.4.1培养形态及染色特性
3.4.1.1于血琼脂平板培养24h～48h，胸膜肺炎放线杆菌（APP)为露珠样的小菌落，直径1mm~2 mm。
3.4.1.2多数菌株产生β溶血带，靠近鸡表皮葡萄球菌菌苔的菌落较大，随着与葡萄球菌生长线的距离增加而变小或不生长，即所谓“卫星现象”。3.4.1.3取典型菌落作革兰氏染色，应为革兰氏阴性小球杆菌，两极着色。继代培养中呈明显多形态。幼龄培养物中偶有成丝状。
3.4.1.4被分离菌具有以下特点即可初步判定为猪胸膜肺炎放线杆菌：a）染色镜检为革兰氏阴性杆菌或多形态；b）在血琼脂培养基上生长具有溶血现象；c）生长培养需要V因子，即具有“卫星现象”。3.4.2生化特性
3.4.2.1V因子需要测定：按3.3接种和3.4.1观察。有“卫星现象”为需要V因子。3.4.2.2尿素酶试验：将分离菌接种于尿素琼脂（见3.1.1.3)斜面上，于37℃温箱中培养3h~12h，斜面变粉红色者为尿素酶试验阳性。3.4.2.3溶血性：将待检菌接种于血琼脂,37C培养18h~24h后观察结果。多数菌株产生β溶血带。3.4.2.4过氧化氢酶试验：取干净的载玻片，在上面滴1滴3%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现则为过氧化氢酶试验阳性。3.4.2.5CAMPI试验：在血琼脂平血上方用具有β溶血的金黄色葡萄球菌划-一-横线，在此横线下方，隔0.3cm~0.5cm处划垂直线接种被检菌，置37℃培养24h，横线与垂直线相邻空间的溶血区明显增大者为阳性。
3.4.2.6糖发酵试验：从琼脂斜面上挑取少量待检菌培养物，接种于糖发酵管（见3.1.2.3)培养液内，于37（温箱内培养2d~~3d，能分解某种糖会产酸或产酸产气。产酸时，可使颜色变黄，产气者于倒置小发酵管内出现气泡。
3.4.2.7被检菌生化特性鉴定详见表1。3.4.2.8被检菌生长特性测定，凡CAMP反应、尿素酶试验均为阳性，能分解D-木糖、甘露醇，不分解棉子糖、阿拉伯胶糖者，并具有3.4.1.4特性的，即可确认为猪胸膜肺炎放线杆菌。表1生化特性鉴定
胸膜肺炎放
V因子需要
尿素酶
溶血性
过氧化氢酶
葡萄糖产酸
阿拉伯胶糖
线杆菌
放线杆菌
分类群
—(13)
1）对 B族β溶血性链球菌的初步鉴定。306
放线杆菌
分类群
放线杆菌
分类群
放线杆菌
分类群
放线杆菌
分类群
副猪嗜
血杆菌
甘露醇
半乳糖
甘露糖
棉子糖
山梨醇
麦芽糖
胸膜肺炎放
线杆菌
放线杆菌
分类群
表1(续）
放线杆菌
分类群
注：“V\为可变；“+”为阳性；“\为阴性；（数字)为百分数。3.4.3型监定
3.4.3.1琼脂扩散试验
放线杆菌
分类群
放线杆菌
分类群
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放线杆菌
分类群
（25)
3.4.3.1.1将初步判定为APP菌按附录B方法制备多糖抗原，作为琼脂扩散抗原。3.4.3.1.2APP112型因子血清。
副猪嗜
血杆菌
3.4.3.1.3琼脂凝胶的制备：取琼脂糖1.0g，氯化钠0.85g，加蒸馏水至100mL，在沸水浴中溶化后，加1%硫柳汞1mL，混勾后按制板所需体积分装（如用25.4mm×76.2mm载玻片，胶厚2mm，需加琼脂凝胶3.87mL），4℃保存备用。3.4.3.1.4琼脂板的制备：临用前，取分装好的4C保存琼脂凝胶管，在沸水中溶化后，倒在水平玻璃板或载玻片上，凝固后按图1打孔，孔径5mm，孔距5mm，胶厚2mm，火焰封底。3.4.3.1.5加样：中间孔加待检菌多糖抗原，周边孔加APP1~12型因子血清和对应型标准株多糖抗原，加量以加满为宜（见图1)。?
待检菌多糖抗原；
Agi Ag12
St~ St2
分别为APP1~12型标准株多糖抗原；分别为App1~12型标准株因子血清。??
图1琼脂扩散示意图
3.4.3.1.6加样完毕后，将凝胶板放入湿盒置37℃温箱中反应，24h后观察并记录结果。3.4.3.2型判定
被检抗原与标准型因子血清之间出现明显清晰的沉淀线，并与标准型抗原和标准型因子血清之间形成的沉淀线完全融合。即可判为该相关血清型。能与其中任何一型呈阳性反应，该菌又具3.4.1.4特性的，即可确认为猪胸膜肺炎放线杆菌。4补体结合试验
4.1材料准备
4.1.1巴比妥缓冲液(VBD),配制方法见附录C。307
NY/T 537—2002
4.1.2抗原、标准阳性血清、标准阴性血清，稀释补体用的标准牛血清。4.1.3溶血素：效价滴定见附录D。4.1.4补体：效价滴定方法见附录E。4.1.5
敏化红细胞：制备方法见附录F。4.1.6标准溶血管：制备方法见附录G。4.2操作方法
待检血清以及标准阴、阳性血清，均用生理盐水作1：10稀释于60℃水浴锅中灭活30min。每份待检血清用2支康氏管（10mm×100mm），每管加人1：10稀释灭活血清0.2mL。其中-管加工作量抗原0.2mL，另一管加VBD液0.2mL。4.2.3
每管加人50%溶血补体量（5CH5o）补体0.4mL。4.2.4
摇匀，放4℃冰箱冷感作15h～18h。4.2.6
每管加人致敏红细胞0.2mL。
表2。
37C水浴30min。
不溶管以1000r/min离心5min，与标准管比色判定。设标准阳性血清、标准阴性血清、补体对照(包括抗原、VBD)以及红细胞对照，各要素加量见表2CF试验操作程序
1：101
5C*H50
红细胞
对照正确
溶血/（%）
5判定
阳性血清
阴性血清
补体对照
:10|1: 10 5C*Hsd2. 5CH1. 25C'H 5C*H.d2. 5C*H1.25CHso:10|1+101:
摇匀，放4C冰箱15h~18h
37C水浴30 min，不溶者1 000 r /min离心5min，与标准管比色判定100
10～30/100
0～50
对照组应符合正确溶血百分比(见表2)，试验方成立，否则应重做。5.1
5.2判定标准：
被检血清1：10稀释≤30%溶血为阳性（+）a）
被检血清1：10稀释>50%溶血为阴性（－）；介于阴、阳性之间为可疑(士)；c）
可疑应重检，仍为可疑判为阳性。d）
6酶联免疫吸附试验(ELISA)
红细胞
6.1材料准备
6.1.1猪放线杆菌胸膜肺炎1～12型ELISA多价抗原、葡萄球菌A蛋白（SPA)辣根过氧化物酶308
(HRP)标记物（HRP-SPA），以及标准阴、阳性血清。6.1.2试验溶液：配制方法见附录H。6.2操作方法
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6.2.1抗原包被：用抗原包被液（见第H.1章），将猪放线杆菌胸膜肺炎ELISA抗原稀释成一个单位的抗原，用微量加样器将稀释好的抗原，加人到酶标板各孔内，每孔50μL，加盖后放37C吸附4h，再转人4℃冰箱放置18h～20h。
6.2.2洗涤：甩掉酶标板孔内的抗原包被液，加人冲洗液（见第H.2章），室温下浸泡2min，甩去冲洗液，用吸水纸吸干并驱除孔内气泡。再重新加入冲洗液，按同法洗两次。6.2.3加人被检血清：被检血清先用血清稀释液（见第H.3章）作1：200稀释，每份血清加两孔，每孔50μL。
6.2.4对照：每块酶标板均设标准阳性、阴性血清和空白孔对照。血清稀释和加量与5.2.3相同，空白对照加血清稀释液50μL。
6.2.5加样完毕后加盖置37℃温箱内40min。6.2.6取出酶标板将其甩干，用冲洗液洗涤4次。洗涤方法同5.2.2。6.2.7加酶标记的SPA：HRP-SPA标记物用稀释液按标签记载之效价稀后使用，每孔内加入50μul。置37C水浴或温箱中30min。6.2.8取出酶标板，将其甩干，用冲洗液冲洗3次，洗涤方法同5.2.2。6.2.9加底物溶液：每孔加人新配制的底物溶液（见第H.4章）100μL，置37C避光反应，待标准阳性血清孔呈现淡黄色时终止反应(反应时间与室温有关约5min～10min）。6.2.10终止反应：每孔加人终止液（见第H.5章)50μL。6.3判定
6.3.1在酶标仪490nm波长处，测定酶标板的每孔光吸收值，求出每份被检两孔的平均光吸收值(S)，除以同板标准阴性两孔的平均光吸收值(N），则得出每份被检血清的的S/N值。判定标准：每份血清1：200倍稀释的S/N值≥4为阳性，S/N≤3.5的为阴性，S/N介于3.5和4之间的为疑似。
6.3.2自测判定：在无酶标仪情况下，可用直接目测方法。对各孔反应液颜色的深浅程度进行比较，被检样品的反应液颜色与标准阳性血清孔的颜色基本相同，呈淡棕红色判为阳性，颜色浅于标准阳性孔或尤色者，判为阴性(判定时酶标板下衬以白色背景）。309
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A.1巧克力琼脂
A.1.1猪肝汤制备
附录A
（规范性附录）
培养基制备
A.1.1.1取洗净新鲜猪肝400g和新鲜猪胃用清水洗1~~2遍后剥离胃粘膜200g，将两组织经绞碎后，放人5000ml.玻璃瓶中，加入无离子水4000ml，按体积分数为1%加人盐酸，于55℃C～56C温箱内消化24h（前8h，每小时摇振1次，然后静置）。A.1.1.2用乳胶管以虹吸法吸取上清，煮沸30min，用氢氧化钠（NaOH)调pH至7.8，分装于500mL盐水瓶中，103.4kPa121C蒸汽灭菌20min，放4℃冰箱备用。A.1.2巧克力琼脂制备
A.1.2.1取A.1.1制备的猪肝汤1瓶，按2%2.5%加人琼脂，加热熔化后，103.4kPa灭菌20min，待冷至50℃时加人脱纤兔血（或羊血），每100mL培养基加人脱纤血8mL，摇匀。A.1.2.2立即放于83C水浴加热5min～10min，边加热边摇动（以血形成小颗粒状凝块为准，夏季灭菌约5min，冬季为10 min)后倾注平Ⅲ或分装于灭菌试管，制成斜面。A.2PPLO琼脂
A.2.1鸡肉汤制备
去脂鸡肉绞碎后，按1：3加无离子水浸泡，置4℃18h24h，次日煮沸30min，乘热用绒布过滤除渣，再用滤纸过滤。分装，103.4kPa灭菌20min，放4℃冰箱备用。A.2.2PPLO琼脂制备
取PPL)琼脂粉（Difco)3.8g，溶于100mL鸡肉汤中，在水浴中加热使其完全熔化后，103.4kPa灭菌15min，冷至55℃时，按无菌要求加人先前已抽滤无菌1%辅酶A和10%葡萄糖各1mL，健康马血清（或鸡血清)5mL，倾注平板或试管，制成斜面，附录B
（规范性附录）
多糖抗原的提取
B.1将接种在PPLO琼脂上生长6h的APP培养物用适量生理盐水洗下，以4000r/min离心15 min，去上清液，再用生理盐水洗一次。B.2沉淀菌体按1：15（V/V)加人无离子水，混勾后置于68℃水浴中，使瓶中菌液接近水浴温度，再加人等体积68℃90%酚液，置68C水浴15min~20min，其间不断搅拌。B.3取出后在冰浴中冷却到 10℃左右。B.4在4C下以7000r/min离心20min，离心后分三层即水层、酚层和不溶解的部分B.5小心吸取上部水层。
B.6将酚层和不溶性物质再加人与B.2中等量的68℃无离子水，搅拌后放68℃水浴15min~～20min，然后再重复B.3~～B.5程序提取一次。B.7将两次收集的水层混合，即为APP琼脂扩散抗原。310
C.1储藏缓冲液的配制
附录C
（规范性附录）
巴比妥缓冲液(VBD)的配制
将下列试剂按次序加人2.000mL体积的容器中：氯化钠
蒸馏水
巴比妥钠
1mol/1.氯化镁溶液3)
0.3mol/L氯化钙溶液3)
蒸馏水加到
再加人1mol/L盐酸
500 ml
1970ml
20 mL～30 mL
混匀，取样用蒸馏水作1：5稀释，检查pH值应为7.2~~7.3，然后置低温冻存。C.2明胶水溶液的配制
C.2.1将1.0g明胶加入100mL蒸馏水中，煮沸溶解。C.2.2用蒸馏水稀释到800ml.，4C冰箱内保存供一周内使用。C.3VBD 液的配制
将1体积的C.1液加到4倍体积C.2液中，播匀置冰箱保存，供当日使用。附录D
（规范性附录）
溶血素效价滴定
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D.1先将溶血素用VBD(见附录C)作1：100稀释(取 0.2 mL含等量甘油的溶血素,加 9.8mLVBD),按表D.1制备6管不同稀释倍数溶血素。溶血素稀释
试管号
稀释倍数
1：100溶血素
1：1000溶血素
单位为毫升
D.2取6以康氏管，分别标上六个溶血素稀释度，每管各加1.0mL标准红细胞悬液（见第F.2章），再加上不同稀释倍数的溶血素1.0mL到相应的管中，37C水浴15min，即成敏化红细胞。D.3用冷至4℃C的VBD液将补体作1：400稀释，放4℃冰箱于2h内使用。2）1mol/l.氯化镁溶液：将20.3g氯化镁（MgCl2~6H20)加人100ml.蒸馏水中。3）0.3mol/l氯化钙溶液：将44g氯化钙(CaCl2·2H,0)加人100mL蒸馏水中。311
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D.4取6支康氏管，分别标上各溶血素稀释度，每管加VBD0.4mL，1：400补体0.4mL（根据补体效价高低，可用大于或小于1：400的稀释度），再在各管内加人不同稀释度溶血素敏化的红细胞悬液0.2 mL。
D.5混后置37C水浴1h,取出后以1000r/min离心5min，与标准溶血管比较（标准溶血管制备见附录G),求得各管溶血度的百分率（见图D.1)。溶血百分率/(%)
游血素稀释度免费标准下载网bzxz
游血百分率
平稚区
1: 80001: 40001: 3000 1: 2500 1: 20002000
图 D. 1溶血素溶血情况举例
40008000
溶血素稀释度
1: 1000
溶血素效价：取平稳区的第二个稀释度（见图D.1），1：2500稀释度为1单位溶血素。附录E
（规范性附录）
补体效价滴定
E.1取4只康氏管，按表E.1加人试剂，混勾，37℃水浴30min，其间摇动次。裹E.1补体效价滴定
1：400稀释补体
致敏红细胞
单位为2毫升
E.2取出后，1000r/min离心5min，与标准溶血管（见附录G)比较，当一管与标准管不能确切相比时，取左右两标准管溶血度平均值。E.35单位50%溶血补体量(5CH5)的确定：先计算每管的溶血比率，溶血百分比/非溶血百分比(例如溶血百分比为35%，则比率为35/10035=0.54)，以每管的溶血比率为横坐标，每管所用1：400补体的毫升数为纵坐标，在双对数坐标纸上作图，现以图E.1表示次补体效价滴定的实例。第1~4管的溶血百分比分别为20%、40%、50%、60%，其相应的比率分别是0.25、0.67、1.0、1.5，在图E.1中可标出1～4管的四点，分别作1、2管和3、4管两点的连线，再取两条连线的中点作第三条连线，从该连线与比率1的相交点向纵坐标引一条与横坐标平行的线，其与纵坐标的交点所表示的毫升数，即为一个单位50%溶血的补体量。本例为1：400补体0.32mL。5单位（5CHs。）则为0.32×5=1.6mL，原补体的稀释数按下式计算：4）-次测定后3个月不需测定。
400 :(0.32 X 5) = X : 0. 4
X 100
100倍稀释补体0.4ml则含有5C'Hso管号
溶血/(%）20
0.10.1 0.2
F.1 阿氏液配制
0.30.40.50.60.70.8 0.91
图E.1补体效价滴定
附录F
（规范性附录）
敏化红细胞制备
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柠檬酸钠（Na:C.H,O，·5H20)0.8g、葡萄糖2.05g、氯化钠0.42g、枸檬酸0.0325g、蒸馏水100ml，将上述成分混勾溶化，56kPa15min灭菌备用。F.2红细胞悬液
采成年公绵羊血液，于阿氏液中稳定3d~5d后使用。用前用VBD液（见附录C)洗34次，最后次以2000r/min离心10min，去上清液，取下层红细胞泥，用VBD液配成670000红细胞/mm2的标准红细胞悬液（即取红细胞泥1.0mL，加VBD液47.77mL）。F.3敏化红细胞
于试验前取标准红细胞悬液加等量的1单位溶血素混合，37C水浴15min郎成。附录G
（规范性附录）
标准溶血管的制备
G.1血红蛋白溶液的制备
取1.0mL标准羊红细胞悬液（见第F.2章），加入装有7.0mL蒸馏水的试管中，充分振荡，使红细胞全部裂解，再加人2.0mLVBD(见附录C)储藏液，充分混合313
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2十分之一标准羊红细胞悬液的制备G.2
将标准羊红细胞悬液作1：10稀释。G.3标准溶血管配制
标准溶血管按表G.1配制。
溶血程度/%)
血红蛋白溶液 /mL
十分之一标准红细胞悬液/mL
摇匀，1000r/min离心5min，冰箱保存。标准溶血管配制
附录H
（规范性附录）
ELISA试验溶液配制（试剂要求分析纯）方法H.1抗原包被液
0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液，碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加双蒸水至1000mL，4℃冰箱保存限一周内使用，经103.4kPa灭菌15min后可长期使用。H.2 冲洗液(0.05 mol/L pH7.4 PBS-Tween20)0.2mol/L磷酸氢二钠210mL，0.2mol/L磷酸二氢钾40mL，加无离子水至1000mL，再加人30 g氯化钠和2mL.Tween 20。
H.3血清稀释液
冲洗液内加人5%犊牛血清即可。H.4底物溶液
0.1mol/L柠檬酸溶液
0.2mol/L磷酸氢二钠
双蒸水
以上三种溶液混匀即为 pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液。取100mLpH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，在pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液100mL内加入40mg邻苯二胺（OPD），临用前加入80μL30%过氧化氢（HO,）。H.5 反应终止液[2 mol/L硫酸(H2SO4)]取浓硫酸（纯度98%)1mL加8mL去离子水即可。314
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