【地方标准】 山羊副流感病毒3型检测技术规程

ICS65.020.30 B40 江苏省地 DB32 方标准 DB32/T36862019 山羊副流感病毒3型检测技术规程Technical regulations for detection of Caprine parainfluenza virus 32019-12-04发布 江苏省市场监督管理局 发布 2019-12-25实施 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起章，本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。DB32/T36862019 本标准主要起草人：李文良、毛立、李基棕、郝飞、刘茂军、杨蕾蕾、孙敏，1范围 山羊副流感病毒3型检测技术规程DB32/T3686-2019 本标准规定了山羊副流感病毒3型（Caprineparaifluenzavirus3，CPIV3）的病原学检测（病毒核酸的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测）、血清学检测（血凝抑制（HI）试验）的技术要求本标准适用于山羊副流感病毒3型及其感染情况的实验室检测。2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541善医诊断样品采集、保存与运输技术规范3病原学检测 3.1材料 微量移液器及吸头、DEPC水处理的离心管、吸头、PCR扩增管、TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC处理水（用水符合GB/T6682规定）、反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、2×一步法RT-PCR反应缓冲液、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物MF/MR、引物qMF/qMR与探针（附录A）。 3.2仪器设备 PCR仪、荧光定量PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪和水平电泳槽、凝胶成相仪（或紫外透射仪）3.3反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）3.3.1样品处理与RNA的提取 采集羊的鼻拭子、气管拭子或肺脏（样品的采集、保存和运输应符合NY/T541相关规定）。取200μL待检样品液至无菌无RNA酶的EP管中，使用TRIzol试剂、RNA提取试剂盒或自动化核酸提取仪等方法提取RNA。 3.3.2RT-PCR反应 RT-PCR反应使用20μL体系：10μL2×一步法RT-PCR反应缓冲液、引物MF/MR各0.5μL（10μmol/L）、0.4μL反转录酶/TaqDNA聚合酶混合液、4μLRNA模板，4.6μLDEPC处理水。反应条件为：45℃反转录30min94℃预变性2min94℃30s，54℃30s，72℃30s，进行35个循环：72℃延伸10min。 3.3.3结果判定 取PCR产物10uL，在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，在凝胶成像系统中观察结果。样品PCR检测产物电泳后有大小为346bp的片段判断为山羊副流感病毒3型核酸阳性，无条带判断为阴性。每次试验应设置阴阳性对照，阴阳性对照应不出现或出现相应大小的条带。1 3.4荧光定量反转录-聚合酶链式反应（荧光定量RT-PCR）3.4.1核酸提取与荧光定量RT-PCR反应DB32/T3686-2019 核酸提取同3.3.1。荧光定量RT-PCR反应使用20μL体系：10μL2×一步法反应缓冲液，0.4μL反转录酶，0.4μLDNA聚合酶，引物qMF/qMR各0.4μL（10μmol/L），0.8μL探针，0.4uL染料，2μLRNA模板，5.2μLDEPC处理水。将PCR管置于荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增，程序如下：42℃5min：95℃10s：95℃5s，60℃34s，共进行40个循环。3.4.2荧光定量RT-PCR结果判定 阳性对照扩增曲线呈标准的S曲线，且Ct值<30。阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线。若样本曲线呈S形曲线，且Ct值<38为阳性：未出现扩增曲线为阴性。4血清学检测血凝抑制（HI）试验4.1材料 微量移液器及配套吸头、96孔V型微量反应板、生理盐水、1%豚鼠红细胞悬液（配制方法见附录B）、病毒液（相关试验操作应符合GB19489的要求）、标准阳性血清、标准阴性血清。4.2仪器设备 离心机、恒温培养箱。 4.3病毒血凝效价测定 每次HI试验前应对病毒血凝效价进行测定，检测与判定方法如下：一在反应板一排各孔中加25μL生理盐水：一第一孔中加25uL病毒分离液，按照1:2倍比稀释，最后一孔不加抗原作阴性对照。每孔中再加25μLPBS 每孔加25μL1%豚鼠红细胞液，37℃孵育40min；一当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻，红细胞不下滑；红细胞未被凝集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。HA效价为全部红细胞出现凝集时的最高稀释倍数。4.4HI试验 按如下方法进行HI试验： 一一在96孔V型微量反应板各孔中加25证生理盐水：一一加25L经处理的血清于第一孔中，混匀后取25uL加到第2孔中，依次倍比稀释，从第2孔加至第11孔，第11孔混匀后吸取25μL弃去，最后1孔不加血清作为对照；一一每孔中加25μL4个HA单位的病毒抗原，37℃孵育40min；一每孔加25μL1%豚鼠红细胞液，37℃孵育40min。4.5结果判定 将反应板倾斜70度左右，若无凝集反应，则沉淀的红细胞向下滑动，呈流线状，记录为抗体阳性。完全抑制凝集的抗体最高稀释倍数为血清的H抗体滴度，抗体滴度大于等于16为阳性，小于等于8为阴性。若检测发病后双份血清（第一份血清应在临床症状出现后立即采集，第二份血清在两周后采集），抗体滴度上升4倍或4倍以上时，表明羊只近期被感染。2 引物序列 A.1 引物 ME MR qMF qMR CPIV3Probe A.2 引物的溶解 附录A （资料性附录） 引物 表A.1用于RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测的引物、探针靶基因 M基因 M基因 M基因 M基因 M基因 序列（5'-3'） AGTGATCTAGATGATGATCCA GTTATTGATCCAATTGCTGT GCTTGGCTTCTTTGAAATGG GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC DB32/T36862019 产物 346bp 150bp FAM-CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA-TAMRA 引物MF、MR、qMF、qMR用灭菌的DEPC处理水溶解到浓度为10μmol/L：CPIV3Probe用灭菌的DEPC处理水溶解到浓度为10μmol/L。3