【地方标准】 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法

DB32/T3775—2020 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法
RT-LAMP method for Detecting Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

发布日期：2020-04-08
实施日期：2020-05-15
发布单位：江苏省市场监督管理局

前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由南京农业大学提出并归口。本标准起草单位：南京农业大学。本标准主要起草人：姜平、张日腾、白娟、熊富强、王先炜、李玉峰、陈闻。

1 范围
本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测原理、试剂和仪器设备、检测程序和结果判定。
本标准适用于猪临床样品（肺脏、脾脏和血清）和细胞培养物中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测；同时适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒经典型、高致病性、类NADC30型三种基因亚型的分型检测。

2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27401 实验室质量控制规范
动物检疫
兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
NY/T 541
SN/T 1193 基因检验实验室技术要求

3 缩略语
PRRSV: porcine reproductive and respiratory syndrome virus，猪繁殖与呼吸综合征病毒
LAMP: loop-mediated isothermal amplification，环介导的恒温扩增
RT-LAMP: Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，反转录环介导的恒温扩增

4 原理
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）主要引起猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病）。该病毒有美洲型和欧洲型两个血清型。美洲型又有多个基因亚型。我国流行的美洲型PRRSV主要有传统型、高致病性和类NADC30型毒株，其主要区别存在于病毒的Nsp2基因。
环介导的恒温扩增（LAMP）是一种体外恒温核酸扩增技术，用于快速检测DNA。RT-LAMP是一种逆转录LAMP，用于检测RNA。
本标准RT-LAMP根据PRRSV开放阅读框架7（ORF7）基因序列、ORF1a（非结构蛋白Nsp2）基因序列设计4组引物，建立4种RT-LAMP检测方法（即LAMP1、LAMP2、LAMP3和LAMP4），其中LAMP1的特异性引物识别ORF7基因，LAMP2、LAMP3和LAMP4的特异性引物识别Nsp2基因。
每种LAMP引物均包括两对内、外引物（内引物FIP与BIP，外引物F3与B3）和一对环引物（LF与LB）。利用Bst酶启动循环链置换反应，启动互补链合成，通过在同一链上互补序列周而复始形成有很多环状结构的茎环DNA混合物，在恒温条件下完成核酸扩增反应。从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。该检测方法简便快速、敏感特异，不需要昂贵的仪器设备。

5 试剂和仪器设备
5.1 试剂要求
除有特殊说明外，所有生化试剂均为分析纯。RNA提取相关试剂或用品均需经无RNA酶处理。
5.2 引物
PRRSV LAMP检测引物和PRRSV毒株基因亚型鉴别LAMP引物，人工合成（基因序列见附录B.1）。
5.3 通用试剂
裂解液（TRIZOL）；氯仿；0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2）（见附录A.1）；DEPC处理水（见附录A.2）；异丙醇；75%乙醇；耐热M-MLV (RNaseH-) 反转录酶；pMD18-T载体；胶回收试剂盒 (Qiagen)；质粒DNA提取试剂盒 (TaKaRa)；PCR试剂 (Promega)。
5.4 LAMP试剂
10× Bst DNA聚合酶缓冲液 (见附录A.3)；100 mmol/L MgSO4；10 mmol/L dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP)；8 U/μL Bst DNA聚合酶；5 mol/L 甜菜碱 (Betaine)；灭菌双蒸水；SYBR Green I 染料，1000×。
5.5 阴性及阳性对照
5.5.1 阴性对照
pMD18-T空载体质粒。
5.5.2 阳性对照
LAMP1阳性对照为pMD-BB-N质粒（含高致病性PRRSV BB0907毒株ORF7基因）；
LAMP2阳性对照为pMD-S1-Nsp2质粒（含传统型PRRSV S1毒株Nsp2基因）；
LAMP3阳性对照为pMD-BB-Nsp2质粒（含高致病性PRRSV BB0907毒株Nsp2基因）；
LAMP4阳性对照为pMD-FJ-Nsp2质粒（含类NADC30 PRRSV FJ1402毒株Nsp2基因）。
5.6 仪器
高速冷冻离心机，恒温水浴锅，微量移液器（0.5μL～10μL、20μL～200μL、100μL～1000μL），PCR仪，EP反应管（0.5mL、1.5mL），组织匀浆器或研钵。

6 操作程序
6.1 样品处理
按照NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法，采集待检猪的肺脏、脾脏和血清等样品。肺脏、脾脏取约1g，剪碎后按1:3 (V/V) 加入PBS (0.01mol/L，pH7.2)，充分匀浆呈悬液。血清制备方法为：血...