【国家标准(GB)】 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验

GB4789.30—1994
中华人民共和国国家标准
食品卫生微生物学检验
单核细胞增生李斯特氏菌检验
Microbiological examinationoffoodhygieneExamination of ListeriamonocytogenesGB4789.30——1994
主题内容与适用范围免费标准bzxz.net
本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。2引用标准
GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3设备和材料
3.1温箱30℃和25℃。
3.2天平。
500mL三角瓶。
接种环。
接种针。
载玻片。
盖玻片。
显微镜或相差显微镜。
平血。
试管。
均质器。
无菌注射器。
吸管：1mL，10mL。
单核细胞增生李斯特氏菌标准株。3.14
马红球菌
培养基和试剂
含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A1。含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A2。4.3
EB增菌液：见附录A3。
LB增菌液（LB，LB2)：见附录A4。三糖铁（TSI）琼脂：GB4789.28中4.26,4.27。4.6
SIM动力培养基：见附录A5。
血琼脂：GB4789.28中4.6。
改良的McBride(MMA)琼脂：见附录A5。硝酸盐培养基：GB4789.28中3.17。缓冲葡萄糖蛋白陈水（MR和VP试验用）：GB4789.28中3.4。糖发酵培养基：GB4789.28中3.2。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.30—1994
4.12过氧化氢酶试验：GB4789.28中4.38。4.13盐酸吖啶黄（AcriflavineHC1）（Sigma）。4.14萘啶酮酸钠盐（Naladixicacid）（Sigma）。5检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：6操作步骤
6.1样品的收集及处理
无菌采取样品25g（mL）放灭菌质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拦成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。6.2增菌培养
EB增菌液放30土1℃培养48h～7d，LB,增菌液225mL放30土1℃，培养24h，取出0.1mL，加入10mLLB,增菌液中二次增菌。6.3分离培养
菌EB增菌液和LBz二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，放30土1℃48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。
6.4选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于25土1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。
6.5纯培养
将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪陈大豆琼脂培养基（TSA-YE）上，做纯培养供做以下鉴定。
6.6染色镜检
将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4～0.5um×0.5～2.0um；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。6.7生化特性
将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。
单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别表1
硝酸盐还
单核细胞增生李斯特氏菌
(L.monocytogenes)
绵羊李斯特氏菌
(L.ivanovii)
英诺克李斯特氏菌
(L.innocua)
威尔斯李斯特氏菌
(L.welshimeri)
中华人民共和国卫生部1994—03—18批准原
1994—09—01实施
GB4789.30—1994
西尔李斯特氏菌
(L.seeligeri)
格氏李斯特氏菌
(L.grayi)
默氏李斯特氏菌
(L.murrayi)
6．8对小鼠的致病力试验
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，在30℃培养24h，离心，浓缩，使浓缩液每毫升10/mL个细菌，取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，3～5只，观察小鼠死亡情况。致病株于2～5d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌对小鼠有致病性。6.9协同溶血试验（cAMP）
在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌（R.equi），在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不是触及它们，在30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特力的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。
中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.30—1994
附录A
培养基
（补充件）
A1含0.6%酵毒浸膏的胰酷陈大豆肉汤（TSB-YE）A1.1成分
多价陈
酵毒膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
A2.2制法
1000mL
将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌，备用。
A3EB增菌液
A3.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸氢二钾
葡萄糖
蒸馏水
盐酸吖啶黄
萘啶酮酸
A3.2制法
1000mL
15mg/mL
40mg/mL
除吖啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合调pH至7.2～7.4，121℃15min高压灭菌。使用前加吖啶黄溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。
A4李氏增菌肉汤（LB，LBz）
A4.1成分
多价陈
酵母膏
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钠
七叶苷
蒸馏水
A4.2制法
1000mL
将上述成分加热溶解，调pH至7.2～7.4，分装121℃15min高压灭菌。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
GB4789.30—1994
A4.2.1李氏I液（LB）225mL中加入：1%萘啶酮酸（用0.05mo1/L氢氧化钠溶液配制）1%吖啶黄（用灭菌蒸馏水配制）A4.2.2李氏Ⅱ液（LBz）200mL加入：1%萘啶酮酸
1%吖啶黄
无菌分装于10mL大试管中。
A5改良的McBride琼脂（MMA）
A5.1成分
多价陈
牛肉膏
葡萄糖
氯化钠
磷酸氢二钠
苯乙醇
无水甘氨酸
氯化锂
蒸馏水
A5.2制法
1000mL
将上述成分加热搅拌混勺，调pH至7.2～7.4，分装，121℃15min高压灭菌，备用。
A6SIM动力培养基
A6.1成分
多价陈
硫酸铁铵
硫代硫酸钠
蒸馏水
A6.2制法
1000mL
将上述各成分加热混勺，调pH7.2，分装小试管，高压灭菌121℃15min。附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人白竟玉、付萍、李志刚。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。本标准参照采用美国食品药品管理局（FDA）细菌学分析手册（第六版）增补材料第二十九章李斯特氏菌部分（1987）。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施
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