【国家标准(GB)】 致畸试验

中华人民共和国国家标准
致·畸
Teratogenicity test
1生题内容与适用范围
本标准规定了预测环境有害物质对人体产生胚胎毒性及致赚性实验方法。GB 15193.14-94
本标准适用于在我国生产和销售的一切食品原料及食品用产品的致畸性评价。如新资源食品、食品添加剂、食品用包装材料及洗涤消毒剂等。2原理
母体在孕期受到可通过胎盘屏障的某种有害物质作用，影响胚胎的器官分化与发育，导致结构和机能的缺陷，出现胎儿畸形。因此，在受孕动物的胚胎着床后，并已开始进人细胞及器官分化期时投与受试物，可检出该物质对胎儿的致晰作用。3试剂及其配制
实验用水为蒸馏水
3.1甲醛、冰乙酸、2，4，6-三硝基酚，氨氧化钾、甘油、水合氟醛、茜素红。3.2茜素红备液：茜素红-S，50%乙酸饱和液5.0mL，甘油10.0mL，1%水合氯醛溶液60.0mL混合，放入棕色瓶中。
3.3茜素红应用液：取贮备液3~5mL，用1~~2g/100mL氢氮化钾液稀释至1000ml，存于棕色瓶中，
3.4透明液A：甘油200ml、氢氧化钾10g，蒸馏水790mL混合。3.5透明液B：甘油与蒸馏水等量混合。3.6固定液：Bauins液：2,4,6-三硝基酚75份、甲醛20份、冰Z酸5份。4仪器与设备
4.1实验室常用设备。
4.2生物显微镜及体视显微镜。
4.3游标卡尺（百分尺）。
5实验动物
常用试验动物为大鼠、小鼠和家兔。传统致畸应选健康性成熟（90~100d）雌、雄大鼠，雌性应为未交配过的大鼠80～90只，雄鼠减半。6剂量分组
至少设四个组，一个空白对照，3个试验组。剂量原划上可采用1/4、1/16.1/64LDs，或以亚急性毒中华人民共和国卫生部1994-08-10批准1994-08-10实施
GB15193.14—94
性试验的最大无作用剂量为高剂量组，其1/30左右为低剂量组，在其间设一组。对某种新的动物，初次试验可设一阳性对照组。每组至少12只孕鼠。常用阳性对照物有敌枯双（0.51.0mg/kg体重）、五氯酚钠（30mg/kg体重）、阿斯匹林（250~300mg/kg体重）及维生素A25000～40000IU等。7操作步骤
7.1“受孕动物”的检查和给受试物时间性成熟雌、雄大鼠按1：1（或2：1)同笼后，每日早晨观察阴栓（或阴道涂片），查出阴栓（或精子），认为该鼠已交配，当日作为“受孕”零天。如果5d内未交配，应更换雄鼠。检出的“孕鼠”随机分到各组，并称重和编号，在受孕的第7～16d，每天经口给予受试物（按0.5～1.0mL/100g体重计）。受孕的0、7、12、16、20d称体重，并计算给受试物的量。动物交配期室温在20～25℃为宜，环境安静，必要时给予增加麦芽和蛋糕等营养物质。7.2孕鼠处死和检查bzxz.net
大鼠于妊娠第20d，小鼠第18d，兔第29d处死。大鼠用2g/100mL硫喷妥钠1～1.5mL/只腹腔注射，麻醉或直接断头。剖腹取出子宫称重、记录并检查胚胎、着床数、早期吸收胎，迟死胎及活胎数。7.3活胎鼠检查
逐一记录胎仔体重、体长、检查胎鼠外观有无异常，如头部有无脑膨出、露脑、小头、小耳、小眼、无眼和静眼、兔唇、下颌裂，躯干部有无腹壁裂、脐疝、脊柱弯曲，四肢有无小肢、短肢、并趾、多趾、无趾等畸形，尾部有无短尾、卷尾、无尾，肛门有无闭锁。7.4胎鼠骨标本的制作与检查
将每窝1/2的活胎（奇数或偶数）放入95%（V/V)乙醇中固定2～3周，取出胎仔（或可去皮、去内脏及脂肪）流水冲洗数分钟后放入12g/100mL的氢氧化钾溶液内（至少5倍于胎仔体积)8～72h，透明后放入茜素红-S应用液中染色6～48h，并轻摇1～2次/d，至头骨染红为宜。再放入透明液A中1～2d,放入透明液B中2～3d,待骨骼染红而软组织基本褪色，将标本放入小平皿中，用透射光源，在体视显微镜下作整体观察，然后逐步检查骨骼。测量卤门大小、矢状缝的宽度、头顶间骨及后头骨缺损情况，然后检查胸骨的数目，缺失或融合（胸骨为6个，骨化不全时首先缺第5胸骨、次为缺第2胸骨）。肋骨通常12～13对，常见畸形有融合肋、分叉肋、波状肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中断。脊柱发育和椎体数目（颈椎7个，胸椎12～13个，腰椎5～6个，底椎4个，尾椎3～5个）有无融合、纵裂等。最后检查四肢骨。
7.5胎鼠内脏检查
每窝的1/2胎鼠放入Bouins液中，固定两周后作内脏检查。先用自来水冲去固定液，将鼠仰放在石蜡板上，剪去四肢和尾，用刀片从头部到尾部逐段横切或纵切。按不同部位的断面观察器官的大小、形状和相对位置。正常切面见图。
正常切面图
经口从舌与两口角向枕部横切(切面1)，可观察大脑、间脑、正脑、舌及颚裂。a.
GB 15193.14--94
在眼前面作垂直纵切（切面2）、可见鼻部。从头部垂直通过眼球中央作纵切（切面3）。沿头部最大横位处穿过脑作切面（切面4）。以上切面的目的可观察舌裂、颚裂、眼球畸形、脑和脑室异常。沿下颚水平通过颈部中部作横切面5，可观察气管、食管和延脑或脊髓。以后自腹中线剪开胸、腹腔，依次检查心、肺、横瞩膜、肝、胃、肠等脏器的大小、位置，查毕将其摘除，再检查肾脏、输尿管、膀胱、子宫或睾丸位置及发育情况。然后将肾脏切开，观察有无肾孟积水与扩大。8统计方法及结果评定
各种率的检查用X2检验，孕鼠增重用方差分析或非参数统计，胎鼠身长、体重、窝平均活胎数用T检验。结果应能得出受试物是否有母体毒性和胚胎毒性、致畴性，最好能得出量小致畸剂量。为比较不同有害物质的致畸强度，可计算致畸指数，督以致畸指数10以下为不致畸，10～100为致畸，100以上为强致畸。为表示有害物质在食品中存在时人体受害几率，可计算致畸危害指数，如指数大于300说明该物对人危害小，100～300为中等，小于100为大。致畸指数
雌鼠LD5o
最小致畸剂量
致畸危害指数=
附加说明：
本标准由卫生部卫生监督司提出。最大不致畸剂量
最大可能摄入量
本标准由浙江医科大学、卫生部食品卫生监督检验所负责起草。本标准主要起草人黄幸纤、李悠慧、耿桂英。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。1
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