【国家标准(GB)】 饲料中玉米赤霉烯酮的测定

S 65. 120
中华人民共和国国家标准
GH/T19540—2004
饲料中玉米赤霉烯酮的测定
Delermination of zearalcnonc in fccds2004-06-10发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-10-01实施
GE/T195402004
本标证参考三外有关标消、文献，经姚究、改达和验证后制定。本标准非等效AA《美国公帜分析折化半家协分1988年最后通过的土米中于米索爵娣的薄层负进法利19S4年首次通过的玉米、大，饲料中玉米亦烯配的醇联免疫吸对测定法。其中薄展色潜谢定方法为仲裁力法·薛联免疫吸附激定方法为快速筛造方法
本标推由企国标料下业标准化接术委员会偿出。本标准由全国饲科工业标准化技术委员会归口。本标准出产员省微兰物研究所负卖起草：本标证主要起草人：密晓黎、丁贵平、李烈东，良理兴、成拍尚：1充围
饲料中玉米赤需烯酮的测定
GD/T19540—2004
太标准规定广三米赤霉常酮rearalerone，以下称ZEV)的薄层色谱微是方法和融晚免度吸附测定法：
本标准追用丁配合饲料和幅用谷物原料中Z比V的测定薄层色增测注力法的展低应测质为208，醇联免换吸附测定方法的量低检创量为0.21%，2规范性引用文件
下列文性中的条款适过本标准的叫用而成为交标流的条款，凡是注月期并引用文件，其随后所有的修改单（不位括动误的内穿：或修计版均不适用于本标准，然而，效根据本标准达成博议的各方而剂是否可缺用这其文件的受新版本：凡是不注期的引用文件，其最新版本适用于本标准，GB/T5532分标实验室用水规格和试验方法15/！4699，2何料采4法
3薄层色偶沫（仲裁法：
3.1原理
试样中71用三款甲烧星政，壶取流等液-液举收、胶缩，后进行萍层包语分离，限且定景，或闭薄层归描议闻定费光点的质收值，外标法定盘。3.2试剂与材料
所州试利除另有规定，为便用分析池试测。求符合B/T6682中一缴水的规定。3. 2. 1三氯中烷
3.2.2408/[.气载化钳浓液：称胶4R氢氧化钠，加水适量落解，用水粥释至1UUml.3.2.3磷酸游液（1--).
3.2.4磷酸瘤液（13）
3.2.5无水说酸钠：650℃灼烧4h.冷却后贮于干染中各月.3.2.6展，氯烷两-苯-艺酸（82+8+1)。3.2.7：显色剂.20额化钥（AICl，6I1,))第于1mml.艺尊中3.2.8薄层检，称取4g础政G置于乳计中列1:0mT.0.5兴度平基纤维素钠水溶液研磨至潮状。立即倒人游层板涂存器内制新成10cm×20trL.罩度U.3rim的薄层版，在空气中T燥后，用月至预展神层板举前沿次下，标记方向，在105℃:~1.3℃活化：，盘十1解器内保存备用.3.2.97FN标储备游波
警告：
1接触ZEV的客带.需没兴次氯醛纳（NI籍液，牛天后清先备历.2为了安全，分护人员操作时要带工医用乳胶平套。称取适生的ZEN标准品，用中酵！制成约100E/raLZEN标准盗落液，避光于一5以下情存。
标完储备范的银度，用1er：右英比它杯，以巾醇为患比，弃2比V药大吸收峰派长a14mm处，测定吸光值A，情备液中FV的含显（X.)以成克年老升(g/rL)表示.恢(1)计算i
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式十,
A测定的吸光度值
X,.AxMxi0o
M—7EN的率然质量MS&/
。—zEN在厚中的分了吸收要数e一600m/iml：分：比色杯的激经长度，甲位为单来(cm！(1)
3.2.102FN标准工作落满：根据计算均标准传备液的浓变，箱需收收标准解备减(3.2.9)适基，用三点甲烷稀粹成浓度为21g/mL的标准作溶液.3.3仪器与设备
3.3.1小型粉能机。
3.3.2电动报芯器，
3.3.3层板途布器
3.3.4我璃器血：分液漏斗斗。断有玻璃器止均用稀盐酸没池，依次用白米水热播水过涨.3.3.5能转蒸发器，配有200)ml.心形瓶，3.3.6慢速然纤
3.3.7展元槽：250mm×150mm×sum.m（立式，具磨口）3.3.8点样器：1~9L：
3.3.紫外光灯.波长254m，2G5r.m3.3.TS游斥色增打描仅：配有水灯光源。3.4试样制每
按G8/11699,1试料采样方法取得试样，四分送液将戒取约20g：终枪萨，据勺，装人序口十备月，
3.5分析步要
3.5.1试样处理
称敢约20g试样（3.4)（精确至.g：量于具寒锥形瓶加人9ml水和1mL二氟同烷，益瓶室，在报满器工拆瑟1h，加人1lg无水欧钠勾，过诺，量取5m滤波于分减滑斗中，欲管壁慢慢地加人尘至化钢难液（5,.2)0ml.,井轻轻转款1nim,静骨使分层，将三已烷相转移至第二个分端斗中.氢氧化的资（3.2.2)10L主复拉收1次，并轻轻转动1m弃大一氧单烷后.氢氧化钠熔液层升人原分液游斗中，用少量热愉水淋谜第二个分液漏斗，洗被倒人原孩两斗片，再月。二氯中烧年洗2次奔去氯烧层：向素氧化纳游随层中加人5破酸举滤（3.2.31后典用磷融落筱.2.1调节I[值至9.54行于分效清斗中人1mL，氯用癌，派掘.将一甲烷层经盘有约三多水硫校销的慢注法纸的漏+中，滤十依缩短甲·再用1m，一氯烷盘友起取2次，=氛烷层开流」依箱化中最后用少且三氯甲统浣法器洗液全部非于法维报中，真空军小伴职料其金单转彩套点泰试管中，注象气流下蒸室，用？比氧租统籍解露法。超列，供德尽色落点性用，3.5.2点样
在些薄板下消1.5n1~-2cm的基载工，以cm的向距，用点择依次点标准工作游滚（3.2.1）2.5.10 1.20 p1(相当30 ng.100n200a8.200 mg)和试样滤(3.5.1)20p..3. 5. 3展开
将薄层板人有展书充(3,?,e>的展并摘中，展垒离原点13em--1：rn好,取出.吹十。3.5.4观案与确证
总后的薄是板置波长251m禁外光下观案与7FN5g)标点名移值相同处的试样站蓝维色荧为点，芳相同位些上未出现装光点，购试伴中的2EN含盘在本测定方积的最低检测域2
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：C0K/kg以下：如采相同位置上出现美光点，用显色剂（3.2.71对准各荧光点进行喷雾，130加势5min，然斥在65nm紫外光灯下，视寒荧光点由蓝绿色变为蓝紫色，且荧光典明显强.可确证过谁中含有2，十带光点下方用范标记·待扫描定量测定，3.5.5定量测定
3.5.5.1薄层扫描工作条件
光源：商压云灯。
激发液长：5m安射波长：400
险测方式，反射，
获链：可根据斑点大小进行期化。扫描方试此邀打描。
3.5.5.2标准曲载编制
以ZEN标准作落泌质量1g)为核坐标，以峰面积积分值为额半标，经制标准函线，3.6站果计算和表述
报期试推荧光班点峰面积积分值从标准曲线上查出对应的ZFN量（g），试栏中ZFV的含基（X）微克每千克（g/kg志末按（2）成计算。，
武中：
V.试样商3..1)受后定容体积，单信为微外（.V—试撑整点详位积，单位为微升（产I.)：m一一从标准线上激得试样激点上对应的ZEV质量单位为纳克（）ms——是后损取波和当站样的质盘，单位为也(g)。计算结果表尔到小数点后位有敛数字，3.7、重喜性
在重复挖条行下燕得的两次独文樊试站果的相对关他小人十10为。4酶联免吸附测楚法（快速筛选法)4.1原理
克达的检测依归品抗原抗体反应。将HN抗沐的羊就体吸序在做相载体表血，闭人之EN扩休微标ZEN装合构，ZEN起准就试样，在ZE按体与固担截体：表面羊伴综合的同时，游离的ZEN，酸标E√结会物与结合在固体.专面的ZEN抗体竞争，未结合的酶标2FV站合物洗涤除去。加人酶离物，在结合的佛化性用下，无色属物障帽产生蓝负物质。加人案止剂后额色转变为黄色，适以酵标检副仪，在4微长处测吸收值，受光强度与试样中N的浓成比，酵联免疫吸附测定法兵有操作简单，央速放，结果可靠的牡点。日前有专门测定ZEN均酸联免疫检测诚剂金的商品，在分所时适当季专损作说期书，4.2试剂与材料
4.2.1包粒拉体的苯乙烯报量反声板孔或43孔：4.2.2的用聘萨滤
4.2.3标难品培液：精变吸取标充后的标准储备（3,2.9适量，用中醇溶液（1.2.2)配制成2FN环准品降波1--5.依度分别为0g/.5JgL1=g/L4=g/L.135μg/.,4.2.4融标护原落：2N与频根元生化酶结合物，4.2.5抗体落液，节ZEV抗本。
4. 2. 6柠榜酸绥冲率液1.rNa:,H.0,！). m1/L.H：2. 0 1:称取 . 1?1 长柠酸钠3
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NCH0.2H013.7642抗费酸.H,-H,0)如水落等至1I4.2.7底物箱核甲：叫甲基联革胺用柠接酸率冲疮减(.2.6)配微依度为0.4B/1.。4.2.日底动降胶乙取1.5m.L 33%过氧化氧,用柠续酸经冲碎链(4.2.6)希群单14.2.娠物落液实的落激年与版物溶薇乙1：1的合液4.2.10终正液：碗酸液（1+17）。4.3仪器与设备
4.3. 1酶标检测仅：带250m流长。4. 3.2
小型粉碎机，
5μ,1000微量移滋器。
电动振换器。
玻离器血，50的L诺瓶满斗，盘商，4.3.6、效速滤纸、
4.4试样制
4. 5 分析步骤
4.5.1试拌变埋bZxz.net
称取约5试样4精确举0,C1)下0ml具塞锥形瓶4加人25mI申醇液（.2.2)密，提取min取游道过快通滤。1.0液，13.0m描水勾，次试拌离。
4.5.2分析前注章事项
分析前将所有试而平储至室盐：分析后文即将所有式剂放回2·~6℃效箱：在所有培中，醛光，益上微乱硬益：
4.5.3定位
根据需要没定限风法（见壳1>和定其法（览表2），胶足够数质的微孔置微孔架上，标准品和试样两个平等实验，记录标以品孔和试样孔的位量，限量法时控創标术影孔号中的浓为准值/移秘因一、并通应湖卡稀释因子缺之依度在0--135 g/1范用内。表 1 限量法微孔定位
标推品扭度！
标准品窄液？
th ug/1.)
补品密液 :--
4.5.4加试剂
特测试举染
囊 之 定量法微孔定位
15g/1 g135 /L
衡试样酒
在每中依次加人试剂加人50标准深液（4.2.3)索试样液（4.5.)氧相成微孔中：加人L酶杯绪合物(4.2.4)判个微孔中：再加人53nLZEN抗体(1.2.5)到每个微\中。4.5.5反应
将标板轻轻据死，使孔中的试剂摇匀.用温度18.~ac3培育反应10mir。4.5.6洗浇
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将微孔中液体候留到水池内倒配微孔支架，在十净纸巾上轻泊，除去所有残留的液体，脂替魂器加蒸馅水到每个然孔，洗板，此置2min，而排空滋体，垂复洗涤3次，4.5.7显色
加100L底物资滴(4,2. )到年丑，充分提勾,置183.)扣温销中,反应5mi14.5.8禁止
加1M[.终1.液（4.2.10)到每f播沟4.5.9测定
在4sm处，以字气为空谢举测定吸收值。在能1内读效：4.6结果计算和表述
4.6.1限量送
若试详的登没值小于标准品孔的吸收值，即人样心人，超过限尽值：为限性，若试岸我的吸收值人十或举十标准孔节吸收他，即A*款，则小于或等于所设限量值·为阴，表叫洁为标准值（减/1乘以稀释因子，按4.5，1染作，研释图了为100，益势制标准值为5对,成样中ZFN的限量在0 MRkg
4. 6. 2难量法
当分吸收偿，所得的标准或试样的吸收值欺以策一个标理（9标准>的要收供再驱以100+作为白分股汝值A治，胺式（3)计算：
武中：
标非品或试准的强在值：
空的吸收值..
标准由线的绘制，所门算的百分吸收值对应ZHN报度（g/)的半X数坐标作标准曲线围，曲线在5.~135以/，范固内应当减线性，板据试卡的百分收值，翘过标准曲线，查得相对应被度。试样凸ZEN的舍量(X)微克每干克(Pg/kg)表示.按式<4)计算。X=, cxV\
式中：
以标准可缆1.专得相对应试样提取落（4.5,1)中ZEN能度，单为微克每升（产g/1.)：V
试样投取（.1.11体积，单位为些F(mL)：盛菲稀释普数；
试样质量，单位为克（）。
儿算绪果走示到小数点后一位有效微宇，4.7重豆性
在重左性条件下表得的两次独女试结果的相对差值不大下15收4)
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