【国家标准(GB)】 饲料中赭曲霉毒素A的测定

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T19539—2004
饲料中赭曲霉毒素A的测定
Determination of ochratoxin A in feeds2004-06-10发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-10-01实施
GB/T19539—2004
本标准中的薄层色谱方法和酶联免疫吸附测定方法主要依据GB/15009.96一2003%谷物和大豆中赭曲再素A的测定》中薄层色谱方法和卫生部食站卫生监督检验所建立的酶联免疫吸附法。本标谁规是以薄层色谱法为仲裁方法，酶联免疫吸附测定法为快速筛选法。本标准出全国饲料工业标化技术委贸会提出。本标准由全国饲料.业标准化技术委员会归。本标准由江苏省微生物研究所负责起草。本标滩主要起草人密晓黎、袁建兴，李利东、丁贵平、成恒嵩。148
1范围
饲料中藉曲霉舞素A的测定
CB/T19539—2004
本标准规能了赭曲需幕素A(Ochzatoxin A，以下简称OA)的薄层色谱测定片法和酶联免疫吸附测楚方法：
本标准适用于配合饲料、饲用谷物原料中○A的测定。薄层色谱测定方法的最低检测量为2g酶联免吸附测定方法的最低检测量为0.05ng。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标推的引用荫成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件：其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡尼不注川期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法B/T:4699.1饲料采样方法
3薄色法（仲裁法）
3.1原理
试释中的（)A经提取、液-液分配萃取、浓缩，然后进行薄层分离-限量定屋，或用薄层扫描仪测定荧光斑点的荧光强度，外标法定量，3.2试剂与材料
所用试剂除另有规定，均便用分析纯试剂。水符合GB/T6682中级水的规定，3.2. 1 石油醚。
3.2.2甲醇溶波(5545)。
3. 2. 3兰氯甲烷,
3.2. 4 苯-冰乙酸(99±1)。
3.2.540 g/L氯化钠溶液，
3.2.6无水硫酸钠650℃灼烧1h.冷却后贮于干燥器中备用，3.2.7月
展开剂（用时选择一种）
甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(6+3—1.2+0.06);甲苯-乙酸乙酯-中散（6+3十1.4）b)
苯~冰乙酸(9+1)。
3.2.8显色剂：碳酸氢钠乙醇溶液（在100ml.水中溶解6.0碳酸氢钠.加20ml.乙醇），3.2.9薄层板：称取48硅胶G，加约10ml.0.5%羧甲基纤维素钠水溶液于乳钵巾研磨至糊状，立即倒入涂布器内制成10m入2)cm.厚度0.3mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板，除去杂质，吹干，在105℃！10℃活化1h，置于干燥器内保存备用3.2.101A标准储备溶被：
蓉告：
1凡接触OA的容器，需漫入4%次氟酸钠(NaC)溶液，半天后清洗备用。2为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。称取适量的OA标准品，用苯冰乙酸（3.2.4）配制成约10μg/mL0A赋备液，备液置于4℃冰1.49
GB/T19539—2004
籍中避光保存。
标定贮备液的浓度，用1cm石英比色杯，以苯冰乙酸（3.2.4）为参比，在（A的最大吸收峰波长333nm处，测定吸光度值A。储备液中()A的含量（X,)以微克每毫升（μg/mL)表示，按式(1)i算，X: - AXM×100
A\\测定的吸光度值；
M----0A的摩尔质量(M—403 g/mol);E---(A在苯-冰乙酸中的分了吸收系数(e一555 /ol);a比色杯的光径长度，单约为厚米（cm）。3.2.11（)A标准工作溶液：根据训算的0A标准储备液的浓度，精密吸取标准储备液（3.2.10）适量用苯稀释成浓度为1.0 /ml.的标推工作溶液，3.3仪器与设备
3.3.1小型粉碎机。
3.3.2中动摄荡器。
3.3.3薄层板涂布器，
玻璃器皿：分液漏斗、蒸发皿、浓缩瓶。所有玻璃器血均需用稀盐酸漫泡，依砍用白米水、蒸馏水3.3.4理
冲洗。
3.3.5快速定性滤纸，
3. 3. 6展开槽:250 mm×15c mmx50 mm(式,具磨),3. 3.7免费标准bzxz.net
紫外光灯：波长365:m。
3.3.B点样器：1μL~99μL
3.3.9薄层打描仪配有汞灯光源。3.4试样制备
按;B/T14699.1狗料采样方法取得试样，四分法浓缩减取约200g，经粉碎，混勾，装人磨口瓶中务用。
3. 5分析步骤
3.5.1试样处理
称取约 20 g试样(3.4)(精确至 0. Q1 g).置于200 tml.塞锥形瓶中.加 30 mL石油醛 10℃ mL甲醇济液（3.2.2）,瓶塞盖紧。振荡30 min后,通过快速定性滤纸滤人分液漏-斗中,符分层后,放出甲醇水层20 m置于1C0 mL分液漏斗中,用 H 试红测过。般为5~。加人 : 三氯甲烷.振摇2 min,静置分层唇,放出-氯甲烷层于另-个分漏斗中，再用1）ml.三氯甲烷重复振摇提取甲醇水层（在用二氯中烷振播提取时，如发尘乳化现象，可滴加甲醇促使其分层)，将三氟甲烷层合并于同一分被斗中，加人50 1mL~100 ml氟化钠辫被（3.2.5)，振摇，散置分层后.将=氯中烷层放出，经装有约20 g无水硫酸钠的頭璃滞斗流人蒸发血中,将蒸发Ⅲ置热气,上通风挥F。用纳8 mI.一氧甲烷分次将蒸发血中的残迹溶解,转人浓缩瓶中,聋 60℃水浴减压浓缩至于，加人2L萃·乙酸（3.2,1)溶解娥渣，擦勾，供薄色谱点样而：3.5.2点样
在距薄层板小端1,5 m～2 cm的基线.L,以1cm的间距,崩点样器依次点标准工作溶液(3. 2. 11）2 μ1.,4 m..7 μL、10 μI.(相当于 2 n.4 ng,7 ,10 g)和试样液(3. 5. 1)20 I3. 5. 3展开
将薄层板放人有展开剂的展开糟中,展至离原点 13 tm～15 cm,取出,吹干。3.5.4观察与确证
将展升后的薄层板肾于波长365nπ紫外光灯下,观察与0)A标准点（4g)比移值相同处的试样的150
GH/19539--2004
蓝缘色荧光点。若相同位置上未出现荧光点，则试样中的OA含在本测定方法的最低检测量100g/kg以下。如果相同位置上出现荧光点，用显色剂对准各荧光点进行喷雾后吹干，观案荧光点由蓝绿色变为蓝紫色且荧光强度明显加强可确证试样中含有OA，于荧光点下力用铅笔标记待扫描定其测定。
3. 5. 5 定量测定
3.5.5.1薄虚扫描工作条件
光源：高乐汞灯：
激发波长：365m:
发射波长：450 nm
检测存式:反射；
狭缝：可根据斑点大小逊行调节；扫描方式：距齿扫措
3.5.5.2标准曲线绘制
以○A标准工作溶液质量(1g)为横坐标，以蜂面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。3. 6结果计算和表述
根据试样被光斑点峰面积扫播积分值从标准曲线王查出对应的UA质鼠（），试样中0A的含最(X)以微克每千克(ng/kg)表示,按式(2)计算。X-mxV
式中：
V1试样（3.5.1)最后定容体积,单位为微升μl)：.…或样液点样体积，单位为微升（);m——从标准曲线上查得试样液点上对应的0A的质量，单位为纳克(ng)；rle---最活提取液相当试样的质量，单位为克(.g）。计算结果表示到小数点后一位有效数疗。3. 7量剪性
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的相对差值不人于10。4酶联免疫吸附测定法（快速筛选法）4.1原理
方法的检测依据是抗原-抗体反应，将(A抗体的羊抗体吸附在固相载体表面，加人OA抗体、酶标OA结合物OA标准或试样液，在A抗体与固相载体表面羊抗体结合的间时.游离的OA、酶标A结合物与结合在固体表面UA抗体竞争末结合的酶标A结合物洗涤除去。抑人酶底物，在结合的催化作用下，无色底物降解产生有蔬色物质。加人终片剂后颜转变为黄色，通过酶标检测仪，在459 nm被长处测吸收值。吸光强度与试样中A的浓度反比。酶联免疫吸附测定法具有操作简单，快速灵结果可靠的特点，目前有专门测定（)A的酶联免疫检测试游盒的商品。在分析时当考操作说明朽。4.2试剂与材料
4.2.1包被抗体的聚苯乙烯微量反应板2孔或48孔，4.2.270%甲醇溶液。
4.2.30A标准溶液：精密吸取标定后的标准储备液(3.2.0)量·用甲醇溶液(1.2.2)配制成0A标推溶液 1 --5.浓度分别为 0 μg/ L、1 g/L、2 μg/ L,4 μg/L、8 μg/1.4.2. 4酶标抗原溶液:0A与辣根过氧化酶结含物，i1
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4.2.5抗体溶液：0A抗体。
4. 2. 6 柠檬酸缓冲溶液Lc(Na;CH,0） = 0. 1 mol/L. pH = 4. 0):称取 10. 117 1 g 柠檬酸钠(NaC,H,O,·2H.0),13.7642g柠檬酸(CH.H.0)加水溶解至1L4.2.7底物溶液甲：四甲基联苯胺,用柠檬酸缓冲溶液(4,2.6)配成浓度为0.4 g/L.,4.2.8底物溶液乙;取1.5ml. 30%过氧化氢，用柠酸缓冲溶液（4.2.6)稀释至1L，4.2.9底物溶漱：底物溶液甲与物溶液乙11的混合液4.2、10终止被：硫酸溶液（1+17)4.3仪器与设备
4.3.1酶标测定仪：带450nm波长。4.3.2
小型粉碎机。
4.3.350μL,100μL、1009μl.微单称器。4.3.4电动振荡器。
玻璃器皿:50 ml.锥形瓶、踊牛、骨简。4.3.6快速滤纸。
4.4试样制备
间3.4。
4.5分析步骤
4.5.1试样处理
称取约5 B 试样（4.4)精确至 0.0i g),置于 5) ml.具塞锥形瓶中，加人12.5 ml.甲醇溶液(4.2,2),密塞。振荡器(4.3. 4)提取 5 Inin。提取液通过快速滤纸过滤.取1 ml.滤液,加 9 nl.蒸馏水稀释，摇勾，为试样液。
4.5.2分析前注意事项
分析前将所有试剂平衡至室温;分析后立即将所有试剂放回 2℃～8℃冰箱;在所有培育中,避光，盖上微礼板盖，
4.5.3定位
根据需要设定限法（如表1)和定量法（如表2)。取足够数量的微孔置微孔架上,标准品和试样做两个平等实验，记录标准品引和试样孔的位置，限量法时控制标推品孔号中的浓度为限量值/稀释因子,并通过调节娣释因子使之浓度在 0 Hg/E,~-8 /L,范围内表 1 限量法微孔定位
标推液1
(0 μg/1.)
标准势液4
(4μg/1)
待测试样液
表 2定量法微孔定位
标难路液1 ~5
加试剂
2 μg/ L
4 pg/L
8μg/L
试样液
征每孔中次加人试剂，加人501.标准溶液（4.2.3)或试样提取被(4,5.1)至相应微孔中：加人50) ±I.酶标结合物(4.2.4)到每个微孔中;再加人 50 μL 0A抗体(4,2,5)到每个微孔中。152
4. 5. 5反应
将酶标板轻轻摇显，使孔中的试剂摇勾，置温度18℃~30培育反应10min，4.5.6洗涤
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将微孔中液体倾倒到水池内，例置微孔支架，在净纸巾上轻拍，除去所有残留的液休，用移液器版蒸馏水250μl到每个微孔中，洗板，放置2min，再排空液体，重复洗涤3次，4.5.7显色
加100L底物溶波（4.2.9)到每孔中、充分摇匀.置18℃~~30℃恒温箱中，反应5min。4.5.8终止
加100L终止液（4.2.10）到每孔中，摇勾。4. 5. 9测定
在450ntn处，以空气为空白调零，测定吸收值。在60min内读数。4.6结果计算和表述
4,6.1限盘法
若试样孔的吸收值小于标谁品孔的吸收值，即A群孔≤A称雅，超过限量值，为阳性。落战样孔的哦收值大于或等于标准品我的吸收值，即A试性几A准，赋小于或等于所设限量值，为阴性，量值为标准值（g/L)乘以稀释四子。按4.5.1操作，稀释因了为25，若控制标准值为4μ/1时，试样中0A的限量在100μg/kg。4.6.2定量法
百分吸收值：所得的标准或试样的吸收值除以第一个标准（0标）的吸收值再乘以100，作为百分吸收值4%.按式(3)计算。
式中·
A标谁品或试样的吸收值
A空自的吸收值
A×100
标曲线的绘制：所计策的百分吸收值对应)A浓度（严g/I.)的半对数坐标作标准此线图，曲线在1ng/kg～8ng/kg范内应当成线性。根据试样的百分吸收值，通过标准曲线，查得相对应浓度，试样中A的含量(X)以微克每于克(g/kg)表尔，可按式(4)计算。XExVXn
式中：
一从标推均线上查得相对应试样提取液(4.5.1)中0A浓度，单位为微克每升（u/1.).-…-试样提取液(4.5.)体积，单位为毫升（niL）);n——试样稀释倍数；
试样质量，单位为克（g）、
训算结果表示小数点后-位有效数字。4.7重复性
在重复性条件下获得的两软独立测试结果的相对差慎不大于15%。[53
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