【农业行业标准(NY)】 副结核病诊断技术

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T539—2002
副结核病诊断技术
Diagnostic techniques for paratuberculosis2002-08-27 发布
2002-12-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T539--2002
：前言
副结核病（paratuberculosis，Johne's disease）是由副结核分枝杆菌（mycobacteria paratuberculosis）引起的以反负动物为主的一种慢性、消耗性传染病，其临床症状以持续性腹泻和慢性消瘦为特征。该病广泛地分布于世界各国，引起较大的经济损失。世界动物卫生组织［WorldOrganization for AnimalHealth（英），OfficeIntentionaldesEpizootic（法），OIE］将其划为B类传染病，我国也将其划为I类传染病。
副结核病潜伏期长，有的终生感染而不表现出临床症状。至目前为止，尚无治疗该病的有效方法，防治该病的主要方法是监测、隔离和淘汰病畜。目前该病的检疫方法有细菌学检查和免疫学检查。后者主要是包括皮内变态反应、琼脂扩散试验、间接红细胞凝集试验、淋巴细胞转化试验、补体结合反应和酶联免疫吸附试验（ELISA）。本标准提出的补体结合反应、皮内变态反应和ELISA方法与OIE推荐的可选择方法基本一致。
本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标推由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省兽医研究所。本标准起草人：何昭阳、昊玉环、顾万钩、钱爱东。328
1范围
副结核病诊断技术
本标准规定了副结核病的诊断技术。NY/T539-2002
本标准的细菌学检查、皮内变态反应、补体结合反应适用于牛、羊、鹿等动物的副结核病诊断；ELISA检疫方法适用于牛的副结核病诊断。2 细菌学检查
2.1材料准备
0.5%氢氧化钠液、水浴糟、离心机等。抗酸染色法试剂：配制及染色方法见附录A。2.2操作方法
取待检粪样（尽可能取带有粘液或血丝的粪便）15g~~20g，加约3倍量的0.5%氢氧化钠液，混匀，55C水浴乳化30min，以4层沙布过滤，取滤液1000r/min离心5min，去沉渣后，再以3000r/min4000r/min离心30min，去上清，用沉淀涂片。也可以直肠刮取物、病变肠段粘膜直接涂片。火焰固定，抗酸染色（见附录A)后镜检。
2.3结果判定
发现在细胞内有被染成红色、成丛排列的短杆菌即为细菌检查阳性（十），否则判为细菌检查阴性()。
3皮内变态反应试验
3.1材料准备
3.1.1器材
游标卡尺、灭菌的1mL注射器及针头、75%酒精棉、记录本等。3.1.2变应原
副结核分枝杆菌提纯蛋白衍生物（副结核PPD)或禽分枝杆菌提纯蛋白衍生物（禽结核PPD)。3.2操作方法
3.2.1将被检动物编号，在颈侧中三分之一处中部的健康皮肤处剪毛，直径约10cm,将注射部位的皮肤用手捏起，以卡尺测量皮肤皱褶厚度并记录。局部消毒。3.2.2将变应原以灭菌生理盐水稀释至0.5mg/mL,与皮肤呈 15°~~20°的角度进行皮内注射。注射后注射部位应呈现绿豆至黄豆大小的小包。无论动物种类及大小一律皮内注射0.1mL。如注至皮下或溢出，应于离原注射点8 cm以远处补注一针，并在记录中加以说明。3.2.3羊在尾根无毛的皱褶部进行皮内注射。3.3结果判定
注射 72 h观察反应，检查注射部位有无热、肿、痛等炎性反应，并以卡尺测量注射部位的皮肤皱褶厚度。
3.3.1判定标准如下：
a）变态反应阳性（+）：局部有炎性反应，皮厚差≥4 mm。329
NY/T 539—2002
b）变态反应疑似士：局部炎性反应不明显，皮厚差2.1mm~～3.9mm。c）变态反应阴性（一）:局部无反应或炎性反应不明显，皮厚差≤2.0mm。3.3.2羊有反应者（不论皮厚差大小和炎性反应轻重)判为变态反应阳性（+）,无任何反应者判为变态反应阴性（一）。
3.3.3变态反应疑似，应于3个月后复检，于注射部位对侧的相应部位进行皮内注射，72h后仍判为变态反应疑似，则判为变态反应阳性。4补体结合反应试验
4.1材料准备
4.1.1器材
12mm×37mm小试管、试管架、刻度吸管等。4.1.2试剂
3%绵羊红细胞悬液：采集绵羊红细胞放于阿氏液中，4C保存。使用时，以生理盐水洗涤3次，最后一次要求2500r/min离心15min，弃上清得红细胞泥，以生理盐水配制成体积分数为3%的绵羊红细胞悬液。
溶血素、补体、禽分枝杆菌提取的脂多糖抗原、标准阳性血清、标准阴性血清等。4.2操作方法
4.2.1预备试验
4.2.1.1溶血素效价测定
取溶血素0.2mL（商品溶血素加有等量的甘油），加入9.8mL生理盐水，即为1：100稀释，再按表1进行稀释和表2进行溶血素效价测定。表1
试管号
稀释倍数
生理盐水
1100溶血素
1：1 000 溶血素
试管号
稀释倍数
已稀释的溶血素
1：40补体
生理盐水
3%红细胞
结果判定(例）
溶血素稀释表
1:10001:20001:30001
单位为毫升
6 0001:7 0001:8 000119 000
4 0001:5 0001 :
溶血素效价测定表
试验组
单位为毫升
对照组
1:1 0001:20001:3 0001: 4 0001: 50001 :6 0001:7 0001:8 0001:9 000|110000.1
摇勺，37℃水浴10min
以能完全溶血的溶血素最高稀释倍数为1个溶血素单位（即效价）。表2第5管为1个溶血素单位。正式试验时采用4个溶血素单位，即5000/4=1250倍，故正式试验时，将商品溶血素稀释625倍即可。4.2.1.2补体效价测定
将补体以生理盐水进行1：40稀释。3%红细胞悬液与等量的4个单位溶血素混合，即成致敏红细胞。按表3进行补体效价测定。
试管号
1：40补体
生理盐水
2单位抗原
致敏红细胞
结果判定(例)
表3补体效价测定
摇匀，37℃水浴20min
NY/T539--2002
单位为毫升
以能完全溶血的补体最小量为1个补体单位（即效价），正式试验采用2个单位。表3例)的补体单位为0.08,按公式计算出正式试验的补体稀释倍数。即补体的稀释倍数=0.2X40/补体用量一0.2×40/0.08=100，使用时用2个单位补体，即正式使用时，取补体0.2mL，加9.8mL生理盐水即可。
4.2.1.3抗原效价测定
将抗原2mg（冻干品）加入1ml生理盐水使其溶解并做系列稀释，然后按表4进行抗原效价测定。以与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释倍数为1个抗原单位（效价），在表4（例）中1：100为1个抗原单位。正式试验时，使用2个单位抗原，即将抗原做1：50稀释即可。表4抗原效价测定
试管号
抗原稀释倍数
抗原用量
阳性血清
A列1：5
B列1:10
C列1：20
D列１40
阳性血清
E列１；5
生理盐水
2单位补体
致敏红细胞
结果判定(例)
阳性血清
A列1：5
B列1:10
C列1：20
D列1：40
阴性血清
E列1+50
4.2.2正式试验
1：50
摇匀，4℃感作过夜
1：200
摇匀，37℃水浴20min，取出置室温3h后判定#
被检血清，以生理盐水1：5稀释，58℃水浴灭能30min。致敏红细胞、2个单位补体、2个单位抗原。#
单位为毫升
NY/T539—2002
各要素加量如表5所示。
试管号
被检血清 1 : 5
被检血清 1：10
阳性血清 1 10
阴性血清 1 : 10
2个单位抗原
2个单位补体bzxz.net
生理盐水
致敏红细胞
4.3结果判定
试验组
表5正式试验表
对照组
摇匀，4℃感作过夜
37℃感作20min，取出置室温3h后判定6
单位为毫升
红细胞
在对照组成立的前提下（即阳性血清对照管100%抑制溶血、红细胞对照不溶血，其他对照组均为100%溶血）,判定试验管。被检血清1：5为十十十、1：10为+十以上，判为补体结合反应阳性，被检血清1：5为十或＋十，判为补体结合反应可疑；其他情况判为补体结合反应阴性。补体结合反应结果，对照标准溶血管[配制方法见附录B(资料性附录)进行判定：#完全抑制溶血。上清无色透明，红细胞全沉于管底。+十十75%抑制溶血。上清稍带红色，红细胞全沉于管底。+十50%抑制溶血。上清呈浅红色，红细胞半数沉于管底。+25%抑制溶血。上清深红透明，红细胞少量沉于管底。完全溶血。上清深红透明，管底无红细胞。5酶联免疫吸附(ELISA)试验
5.1材料准备
5.1.1器材
ELISA板、酶联免疫检测仪、加样器、洗瓶、恒温箱等。5.1.2试剂
副结核分枝杆菌亲和层析抗原、草分枝杆菌吸收抗原、兔抗牛IgG酶标抗体、牛副结核参考阳性血清和参考阴性血清。
5.1.3溶液配制方法
5.1.3.1抗原稀释液（pH9.6)：碳酸钠（Na2CO:)0.318g，碳酸氢钠（NaHCO3)0.560g，加去离子水少量使其溶解，待完全溶化后补充去离子水至1000mL混匀。5.1.3.2洗液(pH 7.4)：磷酸氢二钠(NazHPO412H,O)2.90g，磷酸二氢钾（KH2POf)0.20g，氯化钠（NaCI)8.0g，氯化钾（KCl)0.20g，吐温-20(Tween-20)0.5mL，去离子水少量使其溶解，待完全溶化后补充去离子水至1000mL，混勾。5.1.3.3血清及酶标抗体稀释液：牛血清白蛋白0.1g，洗液100mL，溶化混勾。5.1.3.4底物溶液（现用现配）：柠檬酸0.467g，磷酸氢二钠（NazHPO4·12H20)1.84lg，加去离子水100mL，溶化后加邻苯二胺0.04g，溶化混勾后加过氧化氢（Hz0,)0.15mL，混勾。332
5.2操作方法
5.2.1抗原包被
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以抗原稀释液（见5.1.3.1)将副结核分枝杆菌亲和层析抗原（见5.1.2)稀释至50μg/mL，每孔包被0.1mL，部分对照孔以牛血清白蛋白（50μg/mL）代替抗原包被。5. 2.2 血清处理
取被检血清、参考阳性血清和参考阴性血清(见 5.1.2)各0.1 mL,分别加生理盐水 0.8 mL,加草分枝杆菌吸收抗原（见5.1.2)0.1mL，混匀，37℃感作1h。各取0.1ml，加0.9mL血清稀释液（见5.1.3.3)混匀即可。
5.2.3正式试验
按表6进行。每个样品加两孔。
表 6 ELISA 试验
抗原包被
牛血清白蛋白包被
待检血清
阳性血清
阴性血清
血清稀释液
工作浓度的
酶标抗体
稀释液
底物溶液
2 mol/LH,SO,(滴）
5.3结果判定
试验组
对照组
37℃湿盒感作3h，冲洗3次，每次3min0.1
37℃湿盒感作1.5h，冲洗3次，每次3min0.1
37℃湿盒内感作1.5h，冲洗3次，每次3min0.1
37C避光感作3×3min
酶标抗体
单位为毫升
在对照组成立的前提下，即参考阳性血清呈棕黄色，参考阴性血清及其他对照孔呈无色或浅黄色，判定检测结果。
5.3.1自测判定
与参考阳性血清孔颜色相当，郎呈棕黄色，判为ELISA阳性（+）。5.3.2酶标仪判定（490nm）
以底物溶液对照孔调零，校正参考阳性血清吸光度(OD)值为1.0(或相应规定值),测定待检孔。当OD≥0.50,判为ELISA阳性（+）;0.40≤OD≤0.49，判为ELISA可疑（±）;OD<0.40，判为ELISA阴性（）。
6综合判定
凡具有2.3、3.3、4.3、5.3中任何项阳性者，均判为副结核病阳性。333
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A.1染色液的配制
A.1.1石炭酸复红液
附录A
（规范性附录）
抗酸染色法（Ziehl-Neelsen染色法）取碱性复红4g，加95%酒精100mL，即为饱和的复红原液。取复红原液1份，加5%石炭酸水溶液9份，混合，滤纸过滤。
A.1.23%盐酸酒精
取纯盐酸3mL，加95%酒精97ml。A.1.3碱性美蓝液
取美蓝2g，加95%酒精100mL，溶解后即为饱和的美蓝原液。取原液30mL，加0.01%氢氧化钾液100mL，混合滤纸过滤。
A.2染色方法
将制好的涂片火焰固定，滴满石炭酸复红液，在酒精灯上加热5min，以冒蒸气不沸腾为度，稍冷，倾去染色液。加3%盐酸酒精脱色至玻片无红色（约1min）。水洗，滴加碱性美蓝液染2min，水洗，干燥，镜检。
附录B
(资料性附录）
标准溶血管的配制
将补体结合反应中的完全溶血管液收集，按表B.1配制标准溶血管。表 B. 1标准溶血管的配制
试管号
溶血程度/%
3%红细胞
本试验完全浴血液
生理盐水
单位为毫升
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