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- DB32/T 3802-2020南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法
标准号：
DB32/T 3802-2020
标准名称：
南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法
标准类别：
江苏省地方标准(DB32)
标准状态：
现行-
发布日期：
2020-05-25 -
实施日期：
2020-06-25 出版语种：
简体中文下载格式：
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标准简介：
本标准规定了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）巢式聚合酶链式反应（polymerasw chain reation，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本标准适用于南美白对虾样品中肝肠孢虫带虫情况的高灵敏定性检测。
其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。
引用标准：GB/T 25878-2010 SC/T 7202.2-2007。
本文档为江苏省地方标准 DB32/T3802—2020《南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法》，详细规定了利用嵌套PCR技术检测南美白对虾肝肠胞虫（EHP）的原理、试剂、仪器设备、操作步骤及结果判定标准。
标准内容部分标准内容：
DB32/T3802—2020
南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法
Detection of Enterocytozoon hepatopenaei in Litopenaeus vannamei by nested PCR
发布日期：2020-05-25
实施日期：2020-06-25
发布单位：江苏省市场监督管理局
前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江苏省海洋水产研究所。本标准主要起草人：万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成婕、范贤平。
1 范围
本标准规定了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本标准适用于南美白对虾样品中肝肠胞虫带虫情况的高灵敏定性检测。其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法
SC/T7202.2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2部分：PCR检测法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 肝肠胞虫 Enterocytozoon hepatopenaei：一种感染对虾肝胰腺、肠道等器官的微孢子虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。
4 技术原理
南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应（PCR）检测方法是以样品DNA为模板，针对其胞壁蛋白基因设计两对特异性巢式寡核苷酸序列为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶的合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两对引物间的DNA片段得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。
5 试剂材料
5.1 在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。
5.2 实验用水为无菌蒸馏水或超纯水。无水乙醇。
5.3 液体石蜡。
5.4 二氧化氯消毒剂。
5.5 电泳琼脂糖。
5.6 1kb DNA Marker。
5.7 Tris平衡酚。
5.8 Taq DNA聚合酶（5U/μL）。
5.9 10x PCR缓冲液（无Mg2+，随Taq DNA聚合酶提供）。
5.10 氯化镁溶液（25mmol/L）。
5.11 dNTP（含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物）。
5.12 20mg/mL 蛋白酶K。
5.13 TE缓冲液、抽提缓冲液、1×电泳缓冲液、6×载样缓冲液、10mol/L乙酸铵。
5.14 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）。
5.15 核酸染料。
5.16 70%乙醇。
5.17 阳性对照为已知受EHP感染的南美白对虾样品；阴性对照为已知未受EHP感染的南美白对虾样品；空白对照为无菌双蒸水。
6 仪器设备
所需仪器设备按照SC/T7202.2—2007中第6章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于新配制的有效氯3.0×10⁻³的二氧化氯消毒剂中5min，经无PCR产物污染的蒸馏水或超纯水充分淋洗干净后方可用于检测。
7 操作步骤
7.1 样品准备
取活体或冰冻南美白对虾或其他生物样品50mg~100mg（环境沉积物样品约500mg），放入灭菌的1.5mL离心管中，避免样品间交叉污染。
7.2 DNA的提取
样品DNA的提取参照SC/T7202.2—2007中7.1.3执行。
7.3 PCR反应体系准备
巢式第一步PCR的反应模板为抽提的样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表1。
【表1 巢式第一步PCR反应预混物组成及反应条件】
试剂 | 25μL体系 | 50μL体系
10×PCR缓冲液 (无Mg2+) | 2.5 μL | 5 μL
MgCl2 (25mmol/L) | 2 μL | 4 μL
DNA模板 (100ng/μL) | 0.5 μL | 1 μL
dNTP (10 mmol/L) | 0.25 μL | 2 μL
引物F1: 5'-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
引物R1: 5'-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
Taq DNA聚合酶 (5U/μL) | 0.25 μL | 0.5 μL
灭菌双蒸水 | 16.75 μL | 33.5 μL
扩增程序：95℃预变性5min；(95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s)循环30次；68℃终延伸5min；4℃保温45s。
产物大小：514bp
7.3.2 巢式第二步PCR的反应模板为稀释1000倍后的第一步PCR产物，反应预混物组成及反应条件见表2。
【表2 巢式第二步PCR反应预混物组成及反应条件】
试剂 | 25μL体系 | 50μL体系
10×PCR缓冲液 (无Mg2+) | 2.5 μL | 5 μL
MgCl2 (25mmol/L) | 2 μL | 4 μL
DNA模板 (第一步PCR产物稀释1000倍) | 0.5 μL | 1 μL
dNTP (10 mmol/L) | 0.25 μL | 2 μL
引物F2: 5'-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
引物R2: 5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
Taq DNA聚合酶 (5U/μL) | 0.5 μL | 0.5 μL
灭菌双蒸水 | 16.75 μL | 33.5 μL
扩增程序：95℃预变性5min；(95℃ 30s、64℃ 30s、68℃ 20s)循环20次；68℃终延伸5min；4℃保温。
产物大小：148bp
7.3.3 3甲壳类动物内参基因PCR的反应模板为抽提的南美白对虾样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表3。
南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法
Detection of Enterocytozoon hepatopenaei in Litopenaeus vannamei by nested PCR
发布日期：2020-05-25
实施日期：2020-06-25
发布单位：江苏省市场监督管理局
前言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江苏省海洋水产研究所。本标准主要起草人：万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成婕、范贤平。
1 范围
本标准规定了南美白对虾（Litopenaeus vannamei）肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）巢式聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。
本标准适用于南美白对虾样品中肝肠胞虫带虫情况的高灵敏定性检测。其他环境生物和饵料生物，以及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T25878—2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）检测PCR法
SC/T7202.2—2007 斑节对虾杆状病毒诊断规程 第2部分：PCR检测法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 肝肠胞虫 Enterocytozoon hepatopenaei：一种感染对虾肝胰腺、肠道等器官的微孢子虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。
4 技术原理
南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应（PCR）检测方法是以样品DNA为模板，针对其胞壁蛋白基因设计两对特异性巢式寡核苷酸序列为引物，在四种脱氧核糖核苷三磷酸存在下，利用DNA聚合酶的合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，使模板上介于两对引物间的DNA片段得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。
5 试剂材料
5.1 在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。
5.2 实验用水为无菌蒸馏水或超纯水。无水乙醇。
5.3 液体石蜡。
5.4 二氧化氯消毒剂。
5.5 电泳琼脂糖。
5.6 1kb DNA Marker。
5.7 Tris平衡酚。
5.8 Taq DNA聚合酶（5U/μL）。
5.9 10x PCR缓冲液（无Mg2+，随Taq DNA聚合酶提供）。
5.10 氯化镁溶液（25mmol/L）。
5.11 dNTP（含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10mmol/L的混合物）。
5.12 20mg/mL 蛋白酶K。
5.13 TE缓冲液、抽提缓冲液、1×电泳缓冲液、6×载样缓冲液、10mol/L乙酸铵。
5.14 酚-三氯甲烷-异戊醇（25:24:1）。
5.15 核酸染料。
5.16 70%乙醇。
5.17 阳性对照为已知受EHP感染的南美白对虾样品；阴性对照为已知未受EHP感染的南美白对虾样品；空白对照为无菌双蒸水。
6 仪器设备
所需仪器设备按照SC/T7202.2—2007中第6章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于新配制的有效氯3.0×10⁻³的二氧化氯消毒剂中5min，经无PCR产物污染的蒸馏水或超纯水充分淋洗干净后方可用于检测。
7 操作步骤
7.1 样品准备
取活体或冰冻南美白对虾或其他生物样品50mg~100mg（环境沉积物样品约500mg），放入灭菌的1.5mL离心管中，避免样品间交叉污染。
7.2 DNA的提取
样品DNA的提取参照SC/T7202.2—2007中7.1.3执行。
7.3 PCR反应体系准备
巢式第一步PCR的反应模板为抽提的样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表1。
【表1 巢式第一步PCR反应预混物组成及反应条件】
试剂 | 25μL体系 | 50μL体系
10×PCR缓冲液 (无Mg2+) | 2.5 μL | 5 μL
MgCl2 (25mmol/L) | 2 μL | 4 μL
DNA模板 (100ng/μL) | 0.5 μL | 1 μL
dNTP (10 mmol/L) | 0.25 μL | 2 μL
引物F1: 5'-TTGCAGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
引物R1: 5'-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
Taq DNA聚合酶 (5U/μL) | 0.25 μL | 0.5 μL
灭菌双蒸水 | 16.75 μL | 33.5 μL
扩增程序：95℃预变性5min；(95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s)循环30次；68℃终延伸5min；4℃保温45s。
产物大小：514bp
7.3.2 巢式第二步PCR的反应模板为稀释1000倍后的第一步PCR产物，反应预混物组成及反应条件见表2。
【表2 巢式第二步PCR反应预混物组成及反应条件】
试剂 | 25μL体系 | 50μL体系
10×PCR缓冲液 (无Mg2+) | 2.5 μL | 5 μL
MgCl2 (25mmol/L) | 2 μL | 4 μL
DNA模板 (第一步PCR产物稀释1000倍) | 0.5 μL | 1 μL
dNTP (10 mmol/L) | 0.25 μL | 2 μL
引物F2: 5'-TTGGCGGCACAATTCTCAAACA-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
引物R2: 5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3' (100ng/μL) | 2 μL | 2 μL
Taq DNA聚合酶 (5U/μL) | 0.5 μL | 0.5 μL
灭菌双蒸水 | 16.75 μL | 33.5 μL
扩增程序：95℃预变性5min；(95℃ 30s、64℃ 30s、68℃ 20s)循环20次；68℃终延伸5min；4℃保温。
产物大小：148bp
7.3.3 3甲壳类动物内参基因PCR的反应模板为抽提的南美白对虾样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表3。
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