【国家标准】 食物中硫胺素维生素的测定方法

中华人民共和国国家标准

食物中硫胺素（维生素 B₁）的

测定方法

Method for determination of thiamine (vitamin B₁)
in foods

1 主题内容与适用范围

本标准规定了用荧光测定法测定食物中硫胺素含量的方法。

本标准适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响噻嗪色素荧光物质的样品。

本方法的最小检出限为 0.05µg。

2 原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线下，噻嗪色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嗪色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。

如样品中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。

3 试剂

3.1 正丁醇：优级纯或重蒸馏的分析纯。

3.2 无水硫酸钠：分析纯。

3.3 淀粉酶。

3.4 水：去离子水或蒸馏水。

3.5 0.1mol/L 盐酸：8.5mL 浓盐酸用水稀释至 1 000mL。

3.6 0.3mol/L 盐酸：25.5mL 浓盐酸用水稀释至 1 000mL。

3.7 2mol/L 乙酸钠溶液：164g 无水乙酸钠或 272g 含水乙酸钠溶于水中稀释至 1 000mL。

3.8 25%氯化钾溶液：250g 氯化钾溶于水中稀释至 1 000mL。

3.9 25%酸性氯化钾溶液：8.5mL 浓盐酸用 25%氯化钾溶液稀释至 1 000mL。

3.10 15%氢氧化钠溶液：15g 氢氧化钠溶于水中稀释至 100mL。

3.11 1%铁氰化钾溶液：1g 铁氰化钾溶液溶于水中稀释至 100mL。放于棕色瓶内保存。

3.12 碱性铁氰化钾溶液：取 4mL 1%铁氰化钾溶液，用 15%氢氧化钠溶液稀释至 60mL。用时现配，避光使用。

3.13 3%乙酸溶液：30mL 冰乙酸用水稀释至 1 000mL。

3.14 活性人造浮石：称取 100g 经 40 目筛的人造浮石，以 10 倍于其容积的 3%热乙酸搅洗 2 次，每次 10min；再用 5 倍于其容积的 25%热氯化钾搅洗 15min；然后再用 3%热乙酸搅洗 10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中

GB 12390—1990

保存。

3.15 硫胺素标准贮备液：准确称取 100mg 经氯化钙干燥 24h 的硫胺素，溶于 0.01mol/L 盐酸中，并稀释至 1 000mL。此溶液每毫升相当 0.1mg 硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。

3.16 硫胺素标准中间液：将硫胺素标准贮备液用 0.01mol/L 盐酸稀释 10 倍。此溶液每毫升相当 10μg 硫胺素。于冰箱中避光可保存数月。

3.17 硫胺素标准使用液：将硫胺素标准中间液用水稀释 100 倍，此溶液每毫升相当 0.1μg 硫胺素。用时现配。

3.18 0.04%溴甲酚绿溶液：称取 0.1g 溴甲酚绿，置于小研钵中，加入 1.4mL 0.1mol/L 氢氧化钠研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至 250mL。

4 仪器设备

4.1 实验室常用仪器设备。

4.2 荧光分光光度计。

4.3 Maizel-Gerson 反应瓶：如图 1 所示。

4.4 盐基交换管：如图 2 所示。

图 1 Maizel-Gerson 反应瓶

图 2 盐基交换管

5 操作步骤

5.1 试样处理

样品采集后用匀浆机打成匀浆（或者将样品尽量粉碎）于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。

5.2 提取

5.2.1 精确称取一定量试样（估计其硫胺素含量约为 10～30μg，一般称取 5～20g 试样），置于 150mL 三角瓶中，加入 50～75mL 0.1mol/L 或 0.3mol/L 盐酸使其溶解，瓶口加盖小烧杯后放入高压锅中加热水解 10.3×10⁴Pa(15lb/in²)30min，凉后取出。

5.2.2 用 2mol/L 乙酸钠调其 pH 值为 4.5（以 0.04%溴甲酚绿为外指示剂）。

5.2.3 按每克试样加入 20mg 淀粉酶的比例加入淀粉酶。于 45～50℃温箱过夜保温（约 16h）。

5.2.4 冷至室温，定容至 100mL，然后混匀过滤，即为提取液。

5.3 净化

5.3.1 用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约 1g 活性人造浮石使之达到交换柱的三分之一高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

GB 12390—1990

5.3.2 用移液管加入提取液 20～80mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为 2～5μg）。

5.3.3 加入约 10mL 热水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复三次。

5.3.4 加入 25%酸性氯化钾（温度为 90℃左右）20mL，收集此液于 25mL 刻度试管内，冷至室温，用 25%酸性氯化钾定容至 25mL，即为试样净化液。

5.3.5 重复 5.3.1～5.3.4，将 20mL 硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替样品提取液，即得到标准净化液。

5.4 氧化

5.4.1 将 5mL 试样净化液分别加入 A、B 两个 Maizel-Gerson 反应瓶。

5.4.2 在避光暗环境中将 3mL 15%氢氧化钠加入反应瓶 A，振摇约 15s，然后加入 10mL 正丁醇；将 3mL 碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶 B，振摇约 15s，然后加入 10mL 正丁醇；将 A、B 两个反应瓶同时用力振摇，准确计时 1.5min。

5.4.3 重复 5.4.1～5.4.2，用标准净化液代替试样净化液。

5.4.4 用黑布遮盖 A、B 反应瓶，静置分层后弃去下层碱性溶液，加入 2～3g 无水硫酸钠使溶液脱水。

5.5 荧光强度的测定

5.5.1 荧光测定条件：

激发波长 365nm；发射波长 435nm；激发波狭缝 5nm；发射波狭缝 5nm。

5.5.2 依次测定下列荧光强度：

1. 试样空白荧光强度（试样反应瓶 A）；
2. 标样空白荧光强度（标准反应瓶 A）；
3. 试样荧光强度（试样反应瓶 B）；
4. 标准荧光强度（标准反应瓶 B）。

6 计算

X=(U-U_b)×(c·V / (S-S_b)) × (V₁/V₂) × (1/m) × (100/1000)

式中：X——样品中硫胺素含量，mg/100g；

U——试样荧光强度；

U_b——试样空白荧光强度；

S——标准荧光强度；

S_b——标准空白荧光强度；

c——硫胺素标准使用液浓度，μg/mL；

V——用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL；

V₁——试样水解后定容之体积，mL；

V₂——试样用于净化的提取液体积，mL；

m——试样质量，g；

100/1000 ——样品含量由 μg/g 换算成 mg/100g 的系数。

7 结果的允许误差

同一实验室同时或重复两次测定结果的相对偏差绝对值≤10%。