【农业标准】 甘蔗花叶病毒检测技术规范

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 1804—2009

甘蔗花叶病毒检测技术规范

Technical criterion of Sugarcane mosaic virus detection

2009-12-22 发布 2010-02-01 实施

中华人民共和国农业部 发布

前言

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。

本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中心。

本标准主要起草人：刘志听、王健华、陈业渊。

甘蔗花叶病毒检测技术规范

警告——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1 范围

本标准规定了甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus, SCMV）双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方法。

本标准适用于甘蔗种茎、甘蔗组培苗中的甘蔗花叶病毒的检测。

2 仪器和用具

2.1 主要仪器

台式冷冻离心机，PCR仪，水平电泳装置，凝胶成像系统，水浴锅，酶标仪，恒温培养箱。

2.2 用具及耗材

微量移液器、研钵、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头。

3 取样

3.1 种茎：取蔗芽及其周围组织约 10 g，心叶约 10 g，4℃条件下保存，最多存放 7 d。

3.2 组培苗：取叶片 1 g～10 g，4℃条件下保存，最多存放 7 d。

4 检测方法

4.1 双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）法

4.1.1 样品制备

从取样(保存)材料中切取 0.5 g～1.0 g 组织，加入 5 mL 抽提缓冲液研磨，4 000 r/min 离心 5 min，取上清制作试样；-20℃条件下保存备用。

阳性样品为已知带 SCMV 的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带 SCMV 的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存。

4.1.2 操作步骤

4.1.2.1 包被抗体：每孔加 100 μL 用包被缓冲液按工作浓度稀释的 SCMV 抗体，37℃保湿孵育 2 h～4 h 或 4℃条件下保温过夜。

4.1.2.2 洗板：用 PBST 洗涤液洗 4 次，每次 3 min～5 min。

4.1.2.3 封闭：每孔加入 200 μL 封闭液，37℃保湿孵育 1 h～2 h。

4.1.2.4 洗板：同 4.1.2.2。

4.1.2.5 加检测样品：每孔加入 100 μL 试样，设阴性、阳性和空白对照（样品提取缓冲液），可根据需要设置重复，37℃条件下保湿孵育 4 h，或 4℃条件过夜。

4.1.2.6 洗板：同 4.1.2.2。

4.1.2.7 加酶标抗体：每孔加入 100 μL 经 PBS 缓冲液稀释至工作浓度的碱性磷酸酯酶标记抗体，37℃保温孵育 2 h～4 h。

4.1.2.8 洗板：同 4.1.2.2。