【农业标准】 胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 1805—2009

胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范

Technical criterion of Cucumber mosaic virus detection on pepper

2009-12-22 发布 2010-02-01 实施

中华人民共和国农业部   发布

前言

本标准的附录 A、附录 B 为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。

本标准起草单位：中国热带农业科学院热带生物技术研究所、国家重要热带作物工程技术研究中心。

本标准主要起草人：刘志昕、王健华、牛立霞、陈业渊。

NY/T 1805—2009

胡椒种苗黄瓜花叶病毒检测技术规范

警告——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1 范围

本标准规定了胡椒种苗黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)及反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方法。

本标准适用于胡椒插条苗以及插条苗校序中的黄瓜花叶病毒的检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

NY/T 360 胡椒插条苗

3 仪器和用具

3.1 主要仪器

台式冷冻离心机、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统、电冰箱、水浴锅、酶标仪、恒温培养箱。

3.2 用具及耗材

微量移液器、研钵、酶联板、离心管、PCR管、移液器吸头。

4 取样

出现花叶症状的疑似病株或插条苗(见NY/T 360)，取显症叶片3片～5片；无症状状插床或插条苗，取完全展开的深绿期叶片3片～5片。于4℃条件下保湿存放待检，最多存放7d。制样时从不同叶片的取适量叶片组织，制备成混合样品。

5 检测方法

5.1 双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法

5.1.1 样品制备

从取样(保存)材料中切取0.5g～1.0g组织，加入5mL抽提缓冲液研磨，4000r/min离心5min，取上清液作试样，4℃条件下保存备用。

阳性样品为已知带CMV的材料或试剂盒提供的阳性对照，阴性样品为已知不带CMV的材料或试剂盒提供的阴性对照，按同样方法制备和保存。

5.1.2 操作步骤

1. 5.1.2.1 包被抗体：每孔加100μL用包被缓冲液按工作浓度稀释的CMV抗体，37℃保温孵育2h～4h或4℃条件下保湿过夜。
2. 5.1.2.2 洗板：用PBS-T洗液洗板4次，每次3min～5min。
3. 5.1.2.3 封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃保温孵育1h～2h。