【农业标准】 接触传染性脓疱皮炎诊断技术

中华人民共和国农业行业标准

NY/T 1244—2006

接触传染性脓疱皮炎诊断技术
Diagnostic techniques for contagious pustular dermatitis

2006-12-06 发布 2007-02-01 实施

前 言

接触传染性脓疱皮炎（Contagious pustular dermatitis, CPD）又称羊口疮（ORF），是由痘病毒科的副痘病毒引起的绵羊和山羊的一种接触传染性、嗜上皮性疾病，以在口、唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征。该病在我国属于第三类动物疫病，临床上很难与羊痒、口蹄疫区别。

本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录。

本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。

本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：农业部动物检疫所、西北农林科技大学。

本标准主要起草人：龚振华，张彦明，曲志娜，郑增忍，郭福生，党岩，李会荣。

接触传染性脓疱皮炎诊断技术

1 范围

本标准规定了接触传染性脓疱皮炎病毒分离试验、电镜检查试验、动物接种试验和琼脂凝胶免疫扩散试验的诊断方法。

本标准适用于接触传染性脓疱皮炎临床诊断和实验室鉴定。

2 病原分离

2.1 器材

100 mL 玻璃细胞培养瓶，CO₂ 培养箱，超净工作台，离心机，倒置显微镜。

2.2 溶液配制

2.2.1 试剂

MEM、犊牛血清、水解乳蛋白、谷氨酰胺、胰蛋白酶（为细胞培养级）、青霉素、链霉素、氯化钠，碳酸氢钠，氯化钾，柠檬酸钠（1个结晶水），磷酸二氢钠（2个结晶水），葡萄糖，酚红，磷酸氢二钠（12个结晶水），硫酸二钾钾，硫酸镁（7个结晶水），无水氯化钙。

2.2.2 溶液

青链霉素（双抗）溶液，3%谷氨酰胺溶液，7.5%的碳酸氢钠溶液，生理盐水，胎羊皮肤细胞生长液，胎羊皮肤细胞维持液，Hanks母液（10倍浓缩液），0.01 mol/L PBS 溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，犊牛睾丸细胞生长液，L-H 溶液，犊牛睾丸细胞维持液。溶液配制方法按附录 A 执行。

2.2.3

原代胎羊皮肤细胞或羊、犊牛睾丸细胞，制备按附录 B 执行。

2.3 样品的准备

2.3.1 样品的采集

2.3.1.1 采集病羊的口、鼻、乳房等部位的痂皮，置于放有干燥剂（硅胶或其他干燥剂）的灭菌烧杯中，置冰盒内送检。

2.3.1.2 采集未破裂的丘疹、水疱液，混合含有 0.01 mol/L PBS 缓冲液的灭菌试管中，置冰盒内送检。0.01 mol/L PBS 缓冲液的体积不能超过丘疹、水疱液体积的 2 倍。

2.3.2 样品的处理

2.3.2.1 将痂皮剪碎，研磨，按 1:5 的比例（W/V）稀释于 0.01 mol/L PBS 缓冲液中，加双抗（青霉素 2000 IU/mL、链霉素 2000 mg/mL），制成悬液。4℃浸渍 16 h~20 h，以 3000 r/min 离心 30 min，取上清液，过滤备用。

2.3.2.2 丘疹、水疱液加双抗（青霉素 2000 IU/mL、链霉素 2000 mg/mL），离心取上清液，稀释、过滤备用。

2.4 病毒分离培养

2.4.1 取 2.3.2 处理好的样品 1 mL，接种单层胎羊皮肤细胞或犊牛睾丸细胞，37℃吸附 1 h，中间摇动一次。

2.4.2 吸附完后每瓶加入 9 mL 维持液，37℃、5% CO₂ 培养箱中培养。

2.4.3 每天观察细胞病变效应（CPE），连续观察 5 d。如果接种后 1 d~5 d 内出现细胞变圆、肿胀，细胞间距增宽，折光性增强，细胞脱落等病变，立即收毒，用方法 5 进行鉴定。如果首代 3 d 无 CPE，则判