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- GB/T 40903—2021 纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、牦牛绒及其混合物

【GB国家标准】 纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、牦牛绒及其混合物
- GB/T40903—2021
- 现行
标准号:
GB/T 40903—2021
标准名称:
纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、牦牛绒及其混合物
标准类别:
国家标准(GB)
标准状态:
现行出版语种:
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标准简介:
GB/T 40903—2021.
警示:本文件的使用可能涉及某些有危险的材料、操作和设备,但并未对此有关的所有安全问题提出建议。用户在使用本文件之前,有责任制定相应的安全和保护措施,并明确其受限制的使用范围。
1范围
GB/T 40903规定了经DNA提取,采用聚合酶链式扩增反应(PCR)鉴别山羊绒、绵羊毛,牦牛绒及其混合物的 DNA定性检测方法。
GB/T 40903适用于山羊绒,绵羊毛.牦牛绒及其混合物的定性检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682—2008,ISO 3696,1987,MOD)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
脱氧核糖核酸deoxyribonucleic acid; DNA
存在于动物纤维细胞的细胞核和线粒体中的,由四种碱基(A:腺嘌呤,C:胞密啶,G:鸟嘌呤,T:胸腺密啶)组成的线性排列的核酸.
注:每种动物纤维的 DNA序列是固有的、一致的。
3.2
动物纤维animal fibres
自动物毛囊生长的,或腺分泌物中得到的纤维。
注:动物纤维主要包括毛发纤维、丝纤维和软体动物分泌纤维(例如山羊绒、绵羊毛或牦牛绒纤维等)。
3.3
缓冲溶液buffer solution
用于使反应溶液pH值保持在规定值内的溶液。
3.4
还原剂
reducing agent

部分标准内容:
CCS W 04
中华人民共和国国家标准
GB/T40903—2021
纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、耗牛绒及其混合物Textiles-Identification of some animal fibres by DNA analysis method-Cashmere,wool,yakandtheirblends(IS018074:2015,M0D)
2021-10-11发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2022-05-01实施
GB/T40903—2021
规范性引用文件
术语和定义
设备和仪器
试验步骤
结果判定·
精密度·
试验报告
附录A(资料性)特定长度的DNA片段PCR扩增附录B(资料性)
额外的DNA纯化
附录C(资料性)等效的DNA抽提方法附录D(资料性)各类纺织产品的应用实例附录E(资料性)方法重复性和再现性参考文献
-rrKaeerkca-
GB/T40903—2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件使用重新起草法修改采用ISO18074:2015《纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、耗牛绒及其混合物》。本文件与ISO18074:2015相比,在结构上有部分调整,具体如下:第2章对应ISO18074:2015中的第3章:第3章对应ISO18074:2015中的第4章;第4章对应ISO18074:2015中的第5章;第5章对应ISO18074:2015中的第2章;附录E对应ISO18074:2015中的附录C;增加了9.5.1,后面章条及表的编号依次顺延;-增加了附录C(资料性)。
本文件与ISO18074:2015的技术性差异及其原因如下:关于规范性引用文件,本文件做了具有技术性差异的调整,以适应我国的技术条件,调整的情况集中反映在第2章“规范性引用文件”中,具体调整如下:·用修改采用国际标准的GB/T6682代替了ISO3696(见7.1);·删除了ISO8655-2(见6.1)。
修改了“动物纤维”的定义,使之更加全面准确(见3.2)。将“梳子”改为“电泳设备及梳子”,并作相应的解释,更具可操作性(见6.13)。增加了“除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂”,对试剂作更详细的规定;对凝胶迁移标记物(7.16)和DNA染色剂(7.20)作了更详细的解释,有利于获得稳定的试验结果(见第7章)。-将含量“100%”改为“均不小于99.0%”,更具可操作性(见7.2)。将Tris的质量由“12.1g\改为\121.1g”,更具可操作性(见7.4)。将样品的粉碎程度从“2mm\调整到\0.2mm”,以更好地裂解(见9.2)。增加了“引物序列”,并将山羊绒、绵羊毛、耗牛绒及通用引物的合成序列信息列人新增的表1中,有利于获得稳定的试验结果(见9.5.1)。将退火温度从“60℃~68℃\改为针对四对引物的“62℃”,并删除了脚注,使试验更加合理(见9.5.3)。
本文件做了下列编辑性改动:
增加了3.2的注;
删除了3.10的注;
删除了7.21的注;
第8章取样中的注改为“参考GB/T40905.1--2021附录A”;一增加了9.4.13的注;
-附录A中的图A.1第4步扩增中,将“12条单链”修正为“16条单链”;附录B中,额外的DNA纯化采用效果更好的磁珠纯化方法替代了ISO18074:2015中的超滤离心的纯化方法;
附录E中,根据样品的实际来源列明了产地,并替换为我国实验室的验证结果;I
-rrKaeerkAca-
GB/T40903—2021
修改了参考文献。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由中国纺织工业联合会提出。本文件由全国纺织品标准化技术委员会(SAC/TC209)归口。本文件起草单位:上海海关工业品与原材料检测技术中心、佛山市睿牛制衣有限公司、安徽燚龙环保科技有限公司、中纺标检验认证股份有限公司、浙江依蕾毛纺织有限公司、浙江盛发纺织印染有限公司、中纺标(深圳)检测有限公司、晋江中纺标检测有限公司、浙江港莎针织品有限公司、新乡化纤股份有限公司、东莞市合标科技有限公司。本文件主要起草人:费静、刘敏华、蔡佳仕、斯颖、魏孟媛、谢跃亭、欧阳月华、夏大峰、唐晓萌、杨俊、余灿、邢善静、屈兴合、沈金明。Ⅱ
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GB/T40903—2021
纺织品DNA分析法鉴别某些特种动物纤维山羊绒、绵羊毛、耗牛绒及其混合物警示:本文件的使用可能涉及某些有危险的材料、操作和设备,但并未对此有关的所有安全问题提出建议。用户在使用本文件之前,有责任制定相应的安全和保护措施,并明确其受限制的使用范围。1范围
本文件规定了经DNA提取,采用聚合酶链式扩增反应(PCR)鉴别山羊绒、绵羊毛、耗牛绒及其混合物的DNA定性检测方法。
本文件适用于山羊绒、绵羊毛,耗牛绒及其混合物的定性检测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件,不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008,ISO3696:1987,MOD)3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
脱氧核糖核酸
deoxyribonucleic acid;DNA
存在于动物纤维细胞的细胞核和线粒体中的,由四种碱基(A:腺呤,C:胞嘧啶,G:鸟嘌呤,T:胸腺嘧啶)组成的线性排列的核酸。注:每种动物纤维的DNA序列是固有的、一致的。3.2
动物纤维animalfibres
自动物毛粪生长的,或腺分泌物中得到的纤维。注:动物纤维主要包括毛发纤维、丝纤维和软体动物分泌纤维(例如山羊绒、绵羊毛或耗牛绒纤维等)。3.3
缓冲溶液buffersolution
用于使反应溶液pH值保持在规定值内的溶液。3.4
还原剂reducingagent
通过还原裂解纤维中的S一S键而使纤维降解的试剂。3.5
DNA扩增DNAamplification
通过PCR法使特定DNA片段产生的扩增。rKaeerkAca-
GB/T40903—2021
PCR法PCRmethod
聚合酶链式反应法。
注:特定长度的DNA片段扩增详见附录A的说明。3.7
PCR扩增DNA聚合酶DNApolymeraseforPCRmethod用于PCR扩增无校正活性且具有热稳定性的DNA聚合酶。3.8
引物primer
小段单链DNA,与模板序列一致,长度约为18bp~30bp,在核酸复制反应时,作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点的多核苷酸链。3.9
引物对primer set
由正向和反向引物组成的一对引物。3.10
山羊绒引物primerforcashmere
与山羊绒线粒体DNA序列一致的引物。3.11
绵羊毛引物primerforwool
与绵羊毛线粒体DNA序列一致的引物。3.12
耗牛绒引物primerforyak
与耗牛绒线粒体DNA序列一致的引物。3.13
凝胶电泳迁移
gel electrophoresismigration检测特定长度的DNA片段的方法。4原理
通过化学和酶的处理抽提出动物纤维中的DNA,经离心沉淀对DNA进行纯化。分别使用山羊绒、绵羊毛、耗牛绒引物,对抽提纯化的DNA进行PCR扩增,通过特定长度片段的电泳迁移来确认动物纤维的种类。通过分别使用所有引物进行试验,观察样品是否扩增,最终完成鉴别。5注意
DNA分析的鉴别结果在样品染色处理程度较轻或是浅色染色的情况下有着很高的准确性。当纺织产品经过深度加工或高温处理时,线粒体DNA可能遭到破坏。在此情况下,由于PCR扩增受到抑制,使鉴别产生一定的困难。纺织产品如受别的物种污染,比如绵羊毛纤维上沾染了山羊绒脂,此种情况可以通过显微镜技术确认。6设备和仪器
6.1微量移液器及吸头:能够准确移取(0~20)μL(±0.20μL),(20~200)μL(±1.60μL),(200~2
-rKaeerkca-
1 000)μL(±8 μL)。
6.2离心管:可承受14000g离心力。GB/T40903-—2021
规格为2mL的离心管用于纯化,0.2mL的反应管用于PCR反应。0.2mL的PCR反应管宜使用PCR仪制造商推荐的产品。
6.3离心管防爆扣:防止加热过程中离心管弹开6.4金属浴加热模块:用于离心管加热,并可保持在80℃士1.0℃。6.5振荡搅拌器:能控制温度至50℃,振荡频率至少为500/min。6.6振荡器:能够固定离心管,振荡频率至少为500次/min。也可用其他等效的设备替代,例如转速至少为30r/min的试管旋转混勾器。6.7离心机:转速至少为14000g,温度可在0℃至室温间调节。6.8超滤离心管:用于获取分子质量大于或等于100kDa的分子。6.9PCR仪:能够精确控制循环的时间和温度。6.10
紫外照射装置。
6.11成像系统。
2可密封塑料盒。
电泳设备及梳子:电泳设备用于电泳迁移试验,梳子用于制胶时形成泳道。6.14研磨仪:用于研磨和混合动物纤维。6.15锥形瓶:200mL。
7试剂
除非另有说明,在分析中所用试剂均为分析纯7.1纯水:使用GB/T6682规定的一级水。水中应无DNA酶(降解DNA)活性,也不应存在足以使引物产生扩增的其他DNA,从而抑制检测。7.2三氮甲烷/异丙醇试剂(含量均不小于99.0%):三氯甲烷,9.6mL;
一异丙醇,400μL。
7.3高氯酸钠溶液:高氟酸钠6.1g,加纯水至10mL。7.41 mol/LTris-HCI[三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐,简称Tris酸]:将121.1g的Tris[三(羟甲基)氨基甲烷]溶于800mL的纯水,加入HCl调节pH值至8.0,使用pH计测量。加纯水至1000mL。7.5500mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸):将186.1g乙二胺四乙酸二钠水合物(EDTA·Naz·2HzO)溶于800mL的纯水,加入Na0H调节pH值至8.0,使用pH计测量。加纯水至1000mL。7.6缓冲溶液A:
-0.1 mol/L Tris-HCl(7.4),5 mL;--500mmol/LEDTA(7.5),2mL;
—十二烷基磺酸钠(SLS)(C1zH2sSO4Na)0.2g;蔗糖,1.2g;
NaCl,170mg;
二硫苏糖醇(DTT),920mg。
加水至10mL。现配现用。
由于DTT不稳定,在其他试剂高温灭菌冷却后,宜再加人DTT以确保其有效性不受影响。-rrKaeerkAca-
GB/T40903—2021
7.7缓冲溶液B:500mmol/LEDTA(7.5),0.2mL,加纯水至100mL。7.8蛋白溶解酶溶液:可采用木瓜蛋白酶溶液,内含10单位的木瓜蛋白酶(如10单位/20μL)。7.9热稳定的DNA聚合酶:无3~5核酸外切酶活性。7.10动物纤维A引物1:山羊绒、牛绒和绵羊毛的上游引物。7.11动物纤维A引物2:山羊绒、耗牛绒和绵羊毛的下游引物。7.12
DNA组成成分(dNTP):适用于PCR实验7.13聚合酶缓冲溶液:为PCR反应的聚合酶提供合适的化学环境。该缓冲液可由聚合酶的制造商设计。
7.14氯化钾(KCI):起到稳定PCR反应的作用。7.15
氯化镁(MgCI):起到稳定PCR反应的作用。7.16凝胶迁移标记物(DNAmarker):已知大小的DNA混合物,用于与未知样品同时进行电泳以提供片段大小的参照。可商业化购买。7.17琼脂糖:一种可用于DNA电泳分离的多糖。7.18电泳迁移指示剂:
甘油,36g;
-500mmol/LEDTA溶液(7.5),6mL;—溴酚蓝,0.25g;
二甲苯蓝,0.25g。
加水至100mL。PCR反应结束后加人PCR体系1/6以上的体积混勾,再取出反应液用于琼脂糖凝胶电泳。也可直接购买商业化产品。7.19电泳迁移缓冲溶液:
-Tris[三(羟甲基)氨基甲烷],242g;冰乙酸,57.1mL;
-EDTA-2Na,7.43g.
溶于纯水,再加纯水至1000mL。用纯水稀释50倍用于电泳。7.20DNA染色剂,溴化乙啶(ethidiumbromide,EB):最常用的核酸荧光染料,可嵌人核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出橘红色荧光。EB溶于电泳缓冲溶液至浓度约为5μg/mL。注:EB有剧毒,也能使用其他等效的替代品。7.21通用DNA引物:山羊绒、绵羊毛和耗牛绒共有的DNA序列。通用引物1为上游引物,通用引物2为下游引物。
8取样
所取样品应有代表性,如果所测样品由多个部分组成,将它们分成儿个独立的部分,并在试验报告中注明。避免互相之间的污染。从每个样品中取两个平行试样。当两者结果不一致时,则不计人试验结果,另外再取两个平行试样进行测试。
注:参考GB/T40905.1—2021附录A。9试验步骤
9.1总则
本试验宜同时进行山羊绒、耗牛绒和绵羊毛引物的扩增检测。4
rKaeerkAca-
9.2试样的粉碎
GB/T40903——2021
取100mg试样,使用剪刀、研磨仪或其他仪器把纤维碎至0.2mm以下的纤维粉末,将50mg纤维粉末置于2mL的离心管中。
9.3DNA的抽提
9.3.1在离心管(9.2)中加入600μL的缓冲溶液A(7.6)。9.3.2盖上管盖,用手上下颠倒几次离心管,使试样浸没在缓冲溶液中。9.3.3使用离心管防爆扣(6.3扣住离心管防止管盖弹开。将离心管置于金属浴加热模块中,调节温度至60℃,保持20min,分别在3min、6min、9min和15min时取出用手振荡10次。每次振荡完就迅速放回金属浴继续加热。
9.3.420min后,将离心管取出并冷却至室温。9.3.5将10个单位的未瓜蛋白酶溶液(7.8)加人离心管(9.3.4)。将离心管加热至50℃,置于振荡搅拌器(6.5),在50℃下以500r/min的频率振荡1h。9.3.6向离心管(9.3.5)中再加人10个单位的木瓜蛋白酶溶液(7.8),保持50℃,以500r/min的频率振荡超过12h。冷却至室温。
9.4DNA纯化
9.4.1在离心管(9.3.6)中加人300μL高氯酸钠溶液(7.3)。使用振荡器(6.6)以500r/min的频率振荡10min。
9.4.2在离心管(9.4.1)中加人三氯甲烷/异丙醇试剂(7.2)300μL。用手颠倒振荡10s。再使用振荡器(6.6)振荡10min使溶液充分混勾(如500r/min旋转振荡,100r/min往复振荡)或者其他设备(如30r/min垂直振荡)。此时溶液变澄清。9.4.3将离心管(9.4.2)于室温以3300g离心1min。然后,使用微量移液器(6.1)移取上清液500μL至一个新的离心管。
9.4.4在离心管(9.4.3)中加人500μL三氯甲烷/异丙醇试剂(7.2),用手颠倒振荡10s。然后使用振荡器(6.6)或者其他设备振荡10 min,使溶液充分混勾。溶液变澄清。9.4.5将离心管(9.4.4)置于室温,5500g离心1min。使用微量移液器(6.1)移取上清液400μL至—个新的离心管。
9.4.6将离心管(9.4.5)置于4℃,13000g离心7min。然后,将350μL上清液移至超滤离心管(6.8)。在管外套上一个新的离心管。
9.4.7将超滤离心装置于4℃,14000g离心12min。DNA溶液在过滤膜上浓缩过滤。
将过滤液弃去。
9.4.8将离心管(9.4.7)套人超滤离心管(6.8)。9.4.9将450μL缓冲溶液B(7.7)加人超滤离心装置DNA浓缩液处,在4C下,14000g离心10min。弃去过滤液。
9.4.10将步骤9.4.8和9.4.9重复两次或更多次以纯化DNA。9.4.11在超滤装置内的DNA浓缩液中,加人20μL缓冲溶液B(7.7)。9.4.12将一个新的离心管倒置于超滤离心装置上方。9.4.13将整个装置倒转直立,置于4℃,1000g离心2min。收集纯化好的DNA溶液。5
-riKacerKAca-
GB/T 40903—2021
该经纯化的DNA溶液用于DNA测试,称之为测试样品DNA。若动物纤维经深色染料染色,很可能还存在PCR反应抑制剂。如此种情况,则可增加附录B中推荐的纯化步骤。
注:附录C提供了另一种等效的DNA抽提纯化方法。9.5DNA的扩增
引物序列
所用引物信息见表1,用纯水将引物稀释到合适的浓度。表1定性PCR扩增所用引物
引物名称
山羊绒
绵羊毛
耗牛绒
2反应体系
上下游
引物序列
gtggtagctatttatctgggctt
gctttattttagcactagaaaccgc
ggagtgcacccaggaaagattc
ccaaccgaaactgttaactcataaggaggataccgcggccgttaaacag
actcctagccccaatactggactaa
gaagctgctgcctgatactgac
gtccttttgagttcattcgtaggctag
对于某些动物纤维A,反应组成如下:测试样品DNA(9.4.13),2μL;热稳定的DNA聚合酶(7.9),1单位1.5单位;动物纤维A,引物1(7.10),1umol/L;动物纤维A,引物2(7.11),1μmol/L;用于验证的通用引物1(7.21),0.5μmol/L;用于验证的通用引物2(7.21),0.5μmol/L;底物核苷酸dATP、dTTPdGTP、dCTP(7.12),每种200μmol/L;聚合酶缓冲溶液(7.13),由酶的供应商设计;KCl,50mmol/L;
-MgCl2,1.5 mmol。
加纯水至50μL。
9.5.3反应条件
PCR扩增的反应条件见表2。
KaeerkAca-
产物大小/bp
最后的延伸
步骤名称
9.5.4DNA扩增的方法
表2PCR仪反应程序
温度/时间
95 ℃/(5 min~10 min)
95℃/30 s
62℃/30 s
72℃/30s
72C/(3min~7min)
4℃/无时间限制
GB/T40903—2021
循环数
9.5.4.1将反应体系的各种试剂按9.5.2使用微量移液器移人PCR反应管,用水补足体系至50μL。9.5.4.2将装有PCR反应液的PCR管放置于PCR仪(6.9)中,并按表2设置反应程序。9.5.4.3运行35个循环。
9.5.4.4当循环结束后,将PCR产物从仪器中取出置于4C冰箱,直到进行下一步操作。9.6DNA扩增产物的检测
9.6.1准备
9.6.1.1将0.9g琼脂糖(7.17)置于200mL锥形瓶中,加人60mL的电泳迁移缓冲溶液(7.19)。加热使琼脂糖彻底溶化。将琼脂糖溶液倒入灌胶盒中,在适当位置插上梳子。室温静置30min或以上使其完全凝结。
9.6.1.2将梳子竖直小心地从凝胶中拔出(非常小心地取出梳子以避免碰坏梳孔)。将凝胶从灌胶盒取出,置于电泳迁移装置。倒人电泳缓冲溶液(7.19)没过凝胶表面3mm~5mm。9.6.2电泳迁移试验
取出10μLPCR扩增产物(9.5.4.4),将其置于一个全新的离心管内。9.6.2.11
向9.6.2.1中所述的离心管中加入2μL电泳迁移指示剂(7.18),用微量移液器吹打混匀。使用微量移液器将混合液(9.6.2.2)小心地加入凝胶上样孔中。9.6.2.3
9.6.2.4取5μL凝胶电泳迁移标记物(7.16)加入一个泳道。9.6.2.5将电压调为100V土50V进行电泳,当指示剂跑到凝胶的2/3处切断电源。9.6.2.6将凝胶置于可密封塑料盒(6.12)中。加人含有EB的溶液100mL,将凝胶在溶液中浸染5min。为了提高信噪比,将凝胶浸在纯水中2min以洗去多余的染料。9.6.2.7将凝胶从可密封塑料盒(6.12)中取出,置于紫外照射装置(6.10)中进行观察,观察由DNA产生的条带,使用成像系统(6.11)并拍照记录。10验证
10.1总述
按照10.2~10.6所述对检测过程进行验证。-rKaeerKa-
GB/T40903—2021
10.2提取后无扩增验证(阴性验证)在9.3描述的DNA抽提过程不投人动物纤维,即DNA反应溶液中无样品DNA。每批试验均需完成一次未添加动物纤维的抽提扩增。无DNA,PCR扩增不会发生。10.3提取后有扩增验证(阳性对照)在9.3描述的DNA抽提过程中投人山羊绒、绵羊毛、耗牛绒的DNA混合物,经抽提,作为通用阳性对照。每次试验均需完成一次添加动物纤维的抽提扩增。该验证可观察到PCR扩增。10.4PCR反应后有扩增的验证
当10.3所述阳性对照未出现扩增片段时,进行本操作。在PCR反应体系中加入指定的单个阳性参照DNA,此时应能观察到特定物种的PCR扩增。10.5PCR反应后无扩增的验证
当10.2所述阴性对照出现了阳性条带时,进行本操作。PCR反应液中不加DNA,应观察不到DNA扩增条带。
10.6PCR反应溶液的扩增验证
若动物纤维的试验结果为阴性,则将DNA标准引物及相应的DNA加入反应体系中进行PCR扩增反应,用以确认PCR反应溶液是否正常。见表3。表3过程验证的方法
验证方法章条号
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DNA提取
DNA纯化
11结果判定
DNA不提取,
PCR过程验证
不加DNA
DNA提取,PCR
过程验证
标准动物纤维
PCR过程验证
DNA加人反应
PCR过程验证
不加DNA
结果判定见表4。表4包含了所有验证的结果,如果结果不确定,重复试验。10.6
PCR 反应溶液
DNA加入反应
当反应体系不含DNA(10.2和10.5)发生了扩增时,此次试验不可信;当验证试验中有加人DNA(10.3、10.4和10.6)却未发生扩增,本次试验也不可信。DNA片段的信号强弱受多种因素的影响,比如染料的浓度,温度等其他因素。因此,针对某个特定片段应通过与其参照迁移DNAmarker的信号强度比较来判定。8
-rrKaeerKa-
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