【国家标准】 食品安全国家标准 食品添加剂 乳酸链球菌素

中华人民共和国国家标准
GB1886.2312023
食品安全国家标准
食品添加剂
2023-09-06发布
乳酸链球菌素
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
食品添加剂
本标准代替GB1886.231—2016《食品安全国家标准本标准与GB1886.231—2016相比，主要变化如下：GB1886.231—2023
乳酸链球菌素》。
一修改了氯化钠的检测方法，将“GB/T5009.42”修改为“GB5009.44—2016中一修改了效价的检测方法。
“银量法》”：
1范围
食品安全国家标准
食品添加剂
乳酸链球菌素
GB1886.231—2023
本标准适用于以脱脂乳固体，或以酵母抽提物等其他含氮物质，以及含碳物质为主要原料，经乳酸乳球菌（Lactococcuslactissubsplactis)发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素（Nisin）。2分子式、结构式和相对分子质量2.1分子式
C143H230O37N42S(Nisin A)
C141H229O3eN4S(NisinZ)
2结构式
H-ile-Dhb—Ala
AsnHis
Ho—LysDhaValHis-Ile—SerAla.Ala
NisinA:第27位氨基酸为组氨酸(His）;NisinZ:第27位氨基酸为天冬酰胺（Asn)3相对分子质量
NisinA：3354.35（按2018年国际相对原子质量）NisinZ：3330.31（按2018年国际相对原子质量）3技术要求
感官要求
感官要求应符合表1的规定。
GB1886.231—2023
浅棕色至乳白色
无异味
理化指标
感官要求
检验方法
将适量试样均匀置于白瓷盘内，于自然光线下观察其色泽和状态理化指标应符合表2的规定。
理化指标
效价/(IU/mg）
干燥减量，*/%
氯化钠，/%
铅(Pb)/(mg/kg)
检验方法
附录 A中A.3
GB5009.3—2016中直接干燥法”GB5009.44—2016中“银量法
GB5009.75或GB5009.12
注：商品化的乳酸链球菌素产品应以符合本标准的乳酸链球菌素为原料，可添加氯化钠、乳固体辅料而制成，其效价符合声称。
微生物指标
微生物指标应符合表3的规定。
菌落总数/(CFU/g）
大肠菌群/（MPN/g）
大肠埃希氏菌/(MPN/g)
沙门氏菌
微生物指标
不得检出/25g
检验方法
GB4789.38
A.1一般规定
附录A
检验方法
GB1886.231—2023
本标准所用试剂和水在没有没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682规定的三级水。试验中所用标准溶液、制剂和制品，在没有注明其他要求时均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。A.2鉴别试验
A.2.1试剂和材料
A.2.1.1盐酸溶液0.02mol/L。
A.2.1.2氢氧化钠溶液：5mol/L。A.2.1.3脱脂牛奶：脂肪含量<1%。A.2.1.4石蕊牛奶培养基。
A.2.1.5检测菌：乳酸乳球菌（ATCC11454,NCIMB8586）。A.2.2分析步骤
A.2.2.1试样储备液制备
称取适量试样溶于盐酸溶液中，使其溶液效价约为1000IU/mL。A.2.2.2对酸溶液的稳定性试验
用盐酸溶液将试样储备液稀释至约50IU/mL，制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5min，按效价测定方法测定煮沸过的试样溶液中Nisin效价。计算煮沸过的试样中Nisin的效价，计算结果在其效价值的(100%±5%)内，表明无显著活性损失。A.2.2.3对碱溶液的稳定性试验
用盐酸溶液将试样储备液稀释至约50IU/mL，制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5min，用氢氧化钠溶液调PH至11.0，将溶液加热到65℃保持30min，冷却，然后滴加盐酸调PH至2.0，用效价测定方法测定最终溶液中Nisin的效价。在按照上述操作处理后会出现抑菌活性几乎完全损失的情况。A.2.2.4不同抑菌物质中Nisin的鉴别A.2.2.4.1乳酸乳球菌的培养：乳酸乳球菌（工作菌株）(ATCC11454，NCIMB8586)在无菌脱脂牛奶中培养，30℃培养18h。
A.2.2.4.2准备1个或多个装有100mL石蕊牛奶培养基的长颈烧瓶，在121℃灭菌15min，将0.1g试样加入该无菌石蕊牛奶培养基中混匀，在室温下静置2h后加入0.1mL检测菌，30℃下培养24h。A.2.2.4.3检测菌（乳酸乳球菌)可在该效价的试样(约1000IU/mL)中生长，但不能在相似浓度的其他抑菌物质中生长。
GB1886.231-2023
A.3效价
A.3.1试剂和材料
A.3.1.1乳酸链球菌素标准品（效价≥1×10°IU/g）。A.3.1.2盐酸溶液：0.02mol/L。A.3.1.3吐温溶液：吐温20:水=1：1。A.3.1.4培养基(S1)：胰蛋白陈0.8%，酵母膏0.5%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钠0.2%，琼脂粉1.2%~1.5%，灭菌后PH6.8~7.0。A.3.1.5检测菌：黄色微球菌，NCIMB8166。A.3.1.60.85%无菌生理盐水。
A.3.2仪器和设备
A.3.2.1打孔器。
A.3.2.2培养箱，精度30℃±1℃。A.3.2.3移液器。
A.3.2.4温度计，精度50℃~(55±1)℃。A.3.2.5灭菌锅。
A.3.2.6电子分析天平，精确到0.00001g。A.3.3分析步骤
A.3.3.1检测菌(NCIMB8166)的培养及菌悬液的制备A.3.3.1.1检测菌的培养
用无菌接种环从甘油管或冻干管中取一环检测菌（NCIMB8166），接种在无菌的S，平皿上，进行自然分离，挑出饱满、边缘光滑的菌落，扩大，接在S，的试管斜面上，在30℃恒温箱中培养24h，放入2℃~5℃冰箱中。
A.3.3.1.2菌株悬浮液的制备
取在冰箱中的检测菌（NCIMB8166），用无菌生理盐水洗脱下来，制成108CFU/mL浓度的细胞悬液，备用。
A.3.3.2平板的制备
配制S，培养基200mL（按比例先把琼脂溶化，依次加入各组分溶解，磷酸氢二钠溶解后加入），经121℃、20min灭菌后，放冷至不低于70℃，加入4mL吐温20溶液，充分摇匀，待冷却到50℃55℃，加入适量已制备好的菌株悬浮液，使培养基中检测菌的最终浓度为1.0×106CFU/mL摇匀，倒入水平放置的已灭菌的平板中，待完全凝固后用直径为7mm打孔器在平板上打出所需的孔数，小心挖掉孔内琼脂，置2℃~5℃冰箱中，准备使用前，移入洁净工作台中吹风1.5h~3.0h后使用（吹风时间按S，培养基的硬度和环境湿度等调整，不宜过份干燥导致培养基开裂，同时控制室内温度最低，尽量不要让检测菌生长）。
A.3.3.3标准品溶液的配制
GB1886.231—2023
准确称取乳酸链球菌素标准品（精确到0.0001g），溶于盐酸溶液中，使最终浓度为2000IU/mL，摇匀，用盐酸稀释成300倍、600倍，即成高、低剂量标准溶液。A.3.3.4试样溶液的配制
称取一定量的试样(精确到0.0001g），用盐酸溶液溶解后，稀释成高、低剂量试样溶液，其乳酸链球菌素含量，按试样估价（C）高、低剂量与标准品溶液高、低剂量大致相当。A.3.3.5滴加溶液
取出存放在冰箱中的平板，用移液器取70uL~80L标准品高剂量溶液，随机滴加到平板的孔中，滴6个孔，再取70μL~80μL标准品低剂量溶液，随机滴加到与高剂量溶液同一平板其余6个孔中。试样溶液和标准品溶液滴在同一平板上，其操作同标准品。A.3.3.6恒温培养
等孔内的溶液渗透完全后，移入30℃恒温箱中培养16h~24h后，测量抑菌圈直径，最佳抑菌圈直径范围为18mm~24mm。
A.3.4结果计算
用卡尺测量抑菌圈直径，取其平均值，按式（A.1)计算效价。+e+
CsH=CgHXK
式中：
CsH一试样的效价，单位为国际单位每毫克（IU/mg）；CBH一试样的估价，单位为国际单位每毫克（IU/mg）；K一高剂量与低剂量浓度的比值；XsH一高剂量试样溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm）；XsL一低剂量试样溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；X一高剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）；XBL一低剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm)若试样估计值不在测定值的90%~110%范围内，需重新估计试样效价，重测。A1www.bzxz.net
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