【YY医药标准】 人类体外辅助生殖技术用医疗器械生物学评价人精子存活试验

ICS11.040.30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T1535—2017
人类体外辅助生殖技术用医疗器械生物学评价
人精子存活试验
Medical devices for human in vitro assisted reproductive technology-Biological evaluation-Human sperm survival assay2017-03-28发布
国家食品药品监督管理总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。YY/T1535—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：上海市计划生育科学研究所、中信湘雅生殖与遗传专科医院、中国食品药品检定研究院。
本标准主要起草人：施惠娟、林戈、孙正怡、顾一骅、章娜、徐丽明、卢光、黄国宁。1
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1范围
人类体外辅助生殖技术用医疗器械生物学评价人精子存活试验
YY/T1535—2017
本标准规定了人类体外辅助生殖技术用医疗器械应用于人精子存活试验的生物学评价的试验方法。
本标准适用于评价在人类体外辅助生殖技术用医疗器械中与精子直接接触的培养液类及器具/耗材类产品可能产生的毒性风险，也适用手评价与卵母细胞或胚胎直接接触的培养液类及器具/耗材类产品可能产生的毒性风险。
本标准不适用于精子制动剂（造成精子运动能力明显下降）、透明质酸酶（影响精子膜，进而影响精子运动）、配子/胚胎冷冻复苏液（明显不利于精子运动）的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品（ISO10993-12：2002，IDT)
YY/T0995人类辅助生殖技术用医疗器械术语和定义3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
YY/T0995中界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
人精子存活试验human sperm survival assay利用人类精子与供试品或其浸提液共孵育后精子活力的变化来间接判断受试物对精子、卵子或胚胎的潜在毒性。
精子活力spermmotility
精液中精子的运动能力，以前向运动精子（progressivemotility，PR）所占全部精子的百分率表示。3.1.3
精子活力测定
test for sperm motility
精子运动能力的测定。
精子活力分级spermmotilitygrading分为前向运动、非前向运动和不活动。前向运动（progressivemotility，PR）是指精子主动地呈线性或沿一大圆周运动，不考虑速度。1
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YY/T1535—2017
非前向运动（non-progressivemotility，NP）是指所有其他非前向运动方式的精子。如以小圆周泳动，精子尾部动力不能驱使头部运动，或仅见精子尾部摆动。不活动（immotility，IM）是指没有运动。3.1.5
sperm motilityindex
精子活力系数
经过一定培养时间后的精子活力与培养开始时精子活力的比值，反映精子活力的变化情况。3.1.6
相对精子活力系数relative spermmotilityindex相同培养时间，试验样品组精子活力系数与阴性对照组精子活力系数的比值，反映供试品对精子活力的影响程度。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ART：辅助生殖技术（AssistedReproductiveTechnology）CASA：计算机辅助精子分析（Computer-AidedSpermAnalysis）HSA：人血清白蛋白（HumanSerumAlbumin）HSSA：人精子存活试验（HumanSpermSurvivalAssay）IM：不活动（Immotility）
NP：非前向运动（Non-progressiveMotility）PR：前向运动（ProgressiveMotility)SMI：精子活力系数（SpermMotilityIndex）4试验方法
4.1概述
本试验是采用优化处理后活力保持在90%以上的人类精子，根据待测产品的功能和特性，在相应培养环节使用待测液体类产品或者与器具/耗材类产品浸提液接触后，37℃继续培养24h，与对照组相比，精子活力未见显著下降，作为可以接受的指标。通过观察精子活力情况来评价待测产品的质量和潜在毒性。
4.2主要仪器、器具及耗材
精子计数板、恒温台、光学显微镜、计数器、计时器、温度计、水平式离心机、超净工作台、CO2培养箱和恒温培养箱。
可以选择经校准的CASA系统作为精子计数和运动分析用仪器。除供试品外，试验的耗材和试剂需无菌并通过胚胎毒性测试，包括取精杯、移液管、微量移液吸头、培养血、圆底培养试管、锥底离心管和孵育液。4.3材料
来源于健康人类精液，精液应采自22岁～35岁健康男性。选用精液的标准是，外观呈现均质性、灰白色，正常精子形态率≥15%，30min内液化，pH>7.2，精液体积≥2mL，精子浓度≥20×10精子/mL，精子活力（前向运动精子百分率）≥50%，且圆细胞浓度<1×10°/mL。2
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4.4方法
4.4.1精子计数和活力测定
4.4.1.1人工计数法
YY/T1535—2017
吸取少量精液，置于计数板上，盖上盖玻片，显微镜下检查。将前向运动、非前向运动和不活动的精子分别计数，至少总计数200个精子，并重复计数一次。精子活力为前向运动精子除以精子总数的百分数，见式（1)：
精子活力=PR+NP+IM×100%
式中：
PR—前向运动的精子数目；
NP—非前向运动的精子数目；
IM不活动的精子数目。
4.4.1.2计算机辅助精子分析法
根据CASA系统仪器制造商提供的使用指南进行精子计数和活力测定。4.4.2精子制备
......(1)
采用上游法制备供试精子样品：取37C预热的含5mg/mLHSA的有缓冲体系的人类精子孵育液置于试管中，取0.5mL新鲜精液插人管底缓慢地加在培养液液面以下。盖紧试管，倾斜45°角置于37C恒温培养箱中培养1h。
竖直试管，取上层溶液约0.6mL溶液，计数，并测定精子活力，记录。使用精子活力≥90%的样品进行下一步试验。
取一份供试精子样品，300g离心5min，弃上清，用含5mg/mLHSA的人类精子孵育液重新悬浮精子，计数，调整精子浓度为（5土2）×10″精子/mL，并等量分成3组。4.4.3供试品制备和加样
4.4.3.1液体类供试品
阴性对照组：使用已通过毒性测试的人类精子孵育液。阳性对照品：在阴性对照样品中添加64μmmol/L的甲醛。供试品组：具体的操作根据供试品产品特性参照附录A进行加样。4.4.3.2器具类供试品
阴性对照组：使用已通过毒性测试的有缓冲体系的人类精子游育液。阳性对照品：在阴性对照组样品中添加64μmmol/L的甲醛。供试品组：参照GB/T16886.12的要求进行制备。使用通过毒性测试的有缓冲体系的人类精子孵育液作为浸提液。具体的操作根据供试品产品特性参照附录A进行加样。4.4.4精子活力测定
将精子和供试品在37℃继续培养24h后，再次测定精子活力。3
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试验结果
试验数据
用至少3份来自不同供体的合格精液进行试验。计算精子SMI和相对SMI，见式（2）、式（3）：SMI=
试验结束时精子活力
试验开始时精子活力
供试样品组SMI
相对SMI=
对照组SMI
4.4.5.2判断标准
试验可接受准则：
（2）
（3）
试验结束时，阴性对照组精子SMI≥0.7，且阳性对照组精子SMI<0.6，认为该份精子样品的试验有效。
受试品存在潜在生物毒性的判断：在三份有效试验中，
a）若供试样品组两份样品的SMI≥0.7，且相对SMI≥0.9，被认为对人类精子的影响可以忽略；b）若供试样品组两份样品的SMI<0.7或相对SMI<0.9，则被认为对人类精子的影响不可以忽略。
试验报告内容
试验报告应包含如下信息：
供试品信息；
试验条件；bzxz.net
3）试验程序；
试验结果；
试验结论。
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步骤名称
精子存活试验
精液优化处理
精子洗涤
精子孵育
洗涤液
上游法
供试品
精子分离液
附录A
（资料性附录）
供试品的试验操作
表A.1供试品的试验操作
操作方法
供试品
有缓冲体系的
人类精子孵育
液（不需CO，培
养条件）
使用供试品进行梯
度离心，来自同一供
体的阴性和阳性对
照组的精液则用经
过毒性测试的精子
分离液进行优化
人类精子孵
育液（需CO
培养条件）
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其他，如受精
液等（需CO
培养条件）
上游法
精子洗涤液
供试品中添加
用含5mg/mLHSA的有缓
冲体系的人类精子孵育液悬
浮精子，恒温培养箱中37℃
孵育24h
终浓度为5mg/
mL的HSA，悬
浮精子，恒温培
养箱中37℃孵
育24h
供试品中添加终浓度为5mg/
mL的HSA，悬浮精子，CO
培养箱中37℃孵育24h，其
他条件同对照组
器具/耗材类
供试品的漫
浸提液中添
加终浓度为
5mg/mL的
HSA，悬浮精
子，恒温培养
箱中37℃孵
育24h
注：器具/耗材类供试品的浸提液参照GB/T16886.12进行制备，浸提溶液选用有缓冲体系的人类精子孵育液。5
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YY/T1535—2017
参考文献
[1]GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验（GB/T16886.1—2011,ISO10993-1:2009,IDT)[2］GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（GB/T16886.5-2003,ISO10993-5.1999,IDT)
[3] ISO 10993-5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 5:Tests for in vitro cyto-toxicity
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印张0.75字数14千字
2017年10月第一版
2017年10月第一次印刷
书号：155066·2-32096定价18.00元
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