【YY医药标准】 医疗器械生物学评价纳米材料:体外细胞毒性试验(MTT试验和LDH试验)

ICS11.040.30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0993—2015
医疗器械生物学评价
纳米材料：
体外细胞毒性试验（MTT试验和LDH试验）Biological evaluation of medical devices-NanomaterialIn vitro cytotoxicity tests (MTT assay and LDH assay)2015-03-02发布
国家食品药品监督管理总局
2016-01-01实施
YY/T0993—2015
规范性引用文件
术语、定义和缩略语
样品、对照品和试剂制备：
细胞系
培养液
试验过程
数据记录与分析
9接受准则
结果评定：
附录A（资料性附录）试剂、耗材及设备目
附录B（资料性附录）96孔板加样模板示例参考文献
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草YY/T0993—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家食品药品监督管理总局提出。本标准由中国食品药品检定研究院归口。本标准起草单位：中国食品药品检定研究院本标准主要起草人：徐丽明、邵安良、袁博、付海洋、姜华、冯晓明、王春仁。YY/T0993—2015
纳米材料引起细胞毒性的机理主要包括对细胞线粒体功能的影响及对细胞膜的损伤，可以分别用3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基-2氢-四氮唑溴（MTT)试验和乳酸脱氢酶（LDH)试验进行检测。然而，有些纳米材料可能对MTT测试和LDH测试有一定的于扰，检测时需要排除于扰因素来获得准确结果。为建立适合纳米材料及组合在医疗器械中纳米材料的细胞毒性评价方法，本标准作为GB/T16886.5细胞毒性试验的补充，增加了排除干扰因素的处理方法以及阳性对照的选择。同时，增加了LDH试验方法，用以定量地评价纳米颗粒对细胞膜的损伤。本标准作为适合纳米材料的MTT试验和LDH试验的试验方法标准，为正确评价纳米材料及组合在医疗器械中纳米材料的细胞毒性提供技术支持。
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1范围
医疗器械生物学评价纳米材料：体外细胞毒性试验（MTT试验和LDH试验）YY/T0993—2015
本标准规定了纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料的体外细胞毒性试验方法、试样制备、操作步骤及评价。
本标准适用于纳米材料及组合在医疗器械中的纳米材料（颗粒或纤维被包裹或结合在一种不能释放或非游离状态的除外）的体外细胞毒性评价，包括以L929为受试细胞的MTT试验和LDH试验本标准是GB/T16886.5的补充，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验GB/T16886.5医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验GB/T16886.12医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
GB/T16886界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
纳米材料
nanomaterial
物质结构在三维空间中至少有一维处于纳米尺度，或由纳米结构单元构成的且具有特殊性质的材料。
纳米材料医疗器械
nanomaterial medical devices组合有或含有纳米材料的医疗器械。3.2
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
APAP：对乙酰氨基酚（acetaminophen）DMSO：二甲基亚磁（dimethylsulfoxide）FBS：胎牛血清（fetal bovine serum）L929：小鼠成纤维细胞（mousefibroblastcell）LDH：乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase）MEM：培养液（modified eaglesmedium）1
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MTT：3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-25-二苯基-2氢-四氮唑漠盐3-（4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2.5-diphenyl-2H-tetrazolium bromidePBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）4样品、对照品和试剂制备
4.1总则
试验样品可选用纳米材料（用于制备含纳米材料医疗器械的原材料）稀释液及纳米材料医疗器械的浸提液。在试验前宜先对材料进行充分的物理化学表征，以便合理地解释生物学反应。例如颗粒的大小和表面化学特性会引起不同的试验结果。每次试验应包括阳性对照和阴性对照试验中使用的试剂耗材及设备详见附录A。注：随着国际纳米毒理学研究的进展和认知水平的提高，鼓励根据供试品的预期用途和自身特性选择更合适的阳性对照和阴性对照。
2样品稀释液或浸提液的制备
4.2.1样品稀释液
纳米材料稀释液：将纳米材料直接稀释于细胞培养液中，制备不同浓度的稀释液4.2.2样品浸提液
4.2.2.1浸提原则
应遵循GB/T16886.12的要求制备浸提液：a
按照GB/T16886.12要求的表面积比取材（应包含纳米材料在内的部分），将纳米材料医疗器械放人浸提介质中进行浸提；
b）也可根据材料特点选择质量比取材。4.2.2.2
浸提介质
浸提介质的选择可参照GB/T16886.5的要求。注1：不同的浸提介质可能会影响纳米颗粒的表面特性，如：颗粒的大小，颗粒的聚集特性、表面电荷的变化，蛋白质及其他物质的吸附、离子的释放等，进而影响纳米材料的细胞毒性反应。因此，浸提介质的选择非常重要，宜阐述选择的理由。
注2：根据目前的认知水平，推荐使用不含血清的细胞培养液做为纳米材料的浸提介质。随着国际纳米毒理学研究的进展和认知水平的提高，鼓励根据试验样品的预期用途和纳米材料自身特性选择更合适的浸提介质4.2.2.3浸提条件
可参照GB/T16886.5的要求
根据目前的认知水平，推荐的浸提条件为：（37士2）℃下不少于24h。在非必需情况下，浸提液无需过滤，把从纳米材料医疗器械中浸提出的含纳米颗粒和离子的浸提液用于试验；如果进行过滤，离心，或其他处置方法，最终报告中应予以说明。对浸提液H的调整也应在报告中说明。
注1：宜避免对浸提液进行处理，例如对pH的调整。2
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注2：随着国际纳米毒理学研究的进展和认知水平的提高，鼓励根据试验样品的预期用途和自身特性选择更合适的浸提条件。
4.2.3无菌要求
试验样品稀释液或浸提液应无菌。4.3对照样品的制备
4.3.1阳性对照
对乙酰氨基酚（APAP)溶液：用培养液配制适当浓度的溶液（推荐浓度为25mmol/L，经过滤除菌后待用），用于阳性对照
注：氧化镉纳米颗粒在相对较低的剂量内能够在许多测试系统中诱导毒性反应，而且具有与其他纳米颗粒相似的颗粒尺寸，因此，被认为可以作为纳米颗粒的阳性对照的候选，聚乙二醇辛基苯基醚溶液（Triton-X-100）：用培养液配制适当浓度的溶液（推荐浓度为1%，经过滤除菌后待用），用于LDH试验的阳性对照。4.3.2阴性对照
选择合适的阴性对照材料，依据GB/T16886.5制备阴性对照。4.4试剂制备
4.4.1MTT试验
4.4.1.1MTT溶液：用PBS配成5mg/mL.4℃避光保存不超过一个月。4.4.1.2甘氨酸缓冲液：0.1mol/L的甘氨酸（M，75.07）,0.1mol/L氯化钠（M.58.44）。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至10.5，室温下储存。4.4.2LDH试验
LDH细胞毒性检测试剂盒（含乳酸脱氢酶重组催化剂，染料溶液）。依照试剂盒的说明准备试剂、
注：选择不同品牌的试剂盒时宜在试验前用阳性对照验证其灵敏度和敏感性。5细胞系
可参照GB/T16886.5选择细胞系，推荐使用L929细胞。也可根据产品的使用部位和特点选择其他能得出相同或更佳结果的细胞系，但需经过验证，证明其反应的重现性和准确性。如果肝脏、肾脏可能为纳米材料的靶器官时，则可选择人源肝肿瘤细胞（humanhepatocarcinomacells)HepG2和猪近曲小管细胞（porcineproximaltubulecells）LLC-PKl。具体试验方法宜参照ASTME25262008。
注：使用冻存细胞时应传代2～3代以后用于试验。6培养液
可参照GB/T16886.5保存和使用培养液，应符合选定细胞系的生长要求3
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7试验过程
7.1概述
本试验是将纳米材料稀释液或纳米材料医疗器械的浸提液接触培养细胞，通过MTT和LDH两种试验方法分别评价对细胞线粒体的毒性作用和对细胞膜的毒性作用。试验中使用的试剂、耗材及设备详见附录A。本试验为在一个试验过程中获得两个试验结果：MTT试验：3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基-2氢-四氮唑溴[3-（4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)a
2.5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide，MTT是一种黄色的水溶性四氮唑染料，可被活细胞还原为紫色非水溶性甲瓒。MTT试验是用二甲基亚矾（DMSO）溶解甲瓒，并通过微孔板分光光度计（酶标仪）定量甲瓒，对比试验组和对照组的吸光值，评估测试样品细胞毒性的方法。LDH试验：乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）是一种细胞质酶，细胞裂解后即释放到b)
细胞外。因此，LDH试验可用于检测细胞膜的完整性。LDH试验原理：1）LDH氧化乳酸形成丙酮酸盐：2）丙酮酸盐和四唑盐反应转化成甲：3）该甲瓒染料可溶于水，并可通过微孔板分光光度计检测。7.2试验步骤
7.2.1准备细胞
可参照GB/T16886.5准备细胞。或者按细胞供应者推荐方法进行。注：本步骤及以下所有试验操作均在无菌条件下进行。7.2.2细胞接种
用细胞培养液（含10%胎牛血清）稀释细胞悬液，调整浓度至1×10个细胞/mL，于96孔板内每孔接种100μ
每个样品或每个浓度5个重复孔（或不少于3个重复孔）。细胞播种和加样可参照附录B。7.2.3细胞培养
37℃、5%二氧化碳、湿度≥90%条件下培养24h（细胞生长至70%～80%的汇合状态）。7.2.4试验样品与对照样品加样bZxz.net
7.2.4.1如果试验样品为纳米材料原材料的稀释液，或可分散于细胞培养液的样品，则每一种纳米材料或样品需测试5～7个不同的浓度（在有剂量-反应关系的范围内进行稀释，并验证试验系统是否有效）。试验样品为纳米材料原材料时，所配纳米颗粒的最高浓度应在其最大可溶性范围内。对于非可溶性金属纳米颗粒，可根据预试验选择最大的毒性浓度为初始浓度（如：细胞生长抑制率在80%左右）；最小浓度宜获得10%左右的细胞生长抑制率。7.2.4.2如果试验样品为含纳米材料医疗器械的浸提液，而且浸提液中纳米材料的含量很低（细胞毒性小于或等于Ⅱ级），则只需测试浸提液原液，无需稀释；但如果浸提液中纳米材料的含量较高（细胞毒性大于或等于Ⅲ级），宜稀释5～7个不同的浓度。在不同浓度的浸提液稀释液中分别添加10%FBS用于试验样品。
注：宜避免对浸提液进行处理，例如对pH值的调整。如需要调整pH值时宜给出说明。4
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取出生长细胞的96孔板，按照模板排列顺序加人100μL的试验样品和对照样品。加样后继续培养24h。
注：每个实验组均设置无细胞加样对照，即指没有细胞，只有培养液，并添加同样试验样品的对照孔，测得的吸光度值作为背景值，在最后的计算时实际样品测定值应扣除无细胞加样的背景值，从而扣除某些纳米颗粒对吸光度测定的干扰。
7.2.5检测
7.2.5.1MTT试验
7.2.5.1.1从培养箱中取出96孔板，弃去准备用作Triton-X-100阳性对照组孔内的液体，加人100μL1%Triton-x-100（4.3.1中制备）。室温下放置10min700g离心3min。7.2.5.1.2从每孔中吸出50μL液体，转移至另一块96孔板（按原来模板的样品分布转移），暂放4℃保存，尽快进行LDH试验（见7.2.5.2）。7.2.5.1.3
3弃去初始96孔板内的所有液体，每孔加200uL的新鲜培养液，7.2.5.1.4每孔再加人50uL的MTT溶液（最终浓度为1mg/mL），37℃下孵育4h。7.2.5.1.5
7.2.5.1.6
7.2.5.1.7
7.2.5.1.8
取出96孔板.700g离心3min。
吸出培养液和MTT溶液。
每孔加200μLDMSO。
每孔添加25uL甘氨酸缓冲液，置振荡器上混勾10min。用酶标仪检测，检测波长570nm，参考波长680nm或根据试验体系验证结果选择其他7.2.5.1.9
波长。
LDH试验
取出已有转移出50uL液体的96孔板（见7.2.5.1.2），每孔加人50μL反应混合液7.2.5.2.1
（见4.4.2），在涡旋混勾器上混。7.2.5.2.2室温下避光孵育30min。7.2.5.2.3用酶标仪检测，检测波长490nm，参考波长680nm或根据试验体系验证结果选择其他波长。
8数据记录与分析
8.1数据记录
所有试验样品、阳性对照、阴性对照和溶剂对照各重复5个孔。全部测试结果应以表格形式记录。在计算时，每个孔的吸光值需要扣除其相应的无细胞加样组的吸光值，然后将5个孔的数值相加后求算术平均值。
8.2计算方法
8.2.1MTT试验
式中：
相对细胞活性，%；
试验样品组的平均吸光值；
.（1)
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ODB——溶剂对照组的平均吸光值。8.2.2LDH试验
式中：
LDH总释放率；%；
试验样品组的平均吸光值：
溶剂对照组的平均吸光值；
Triton-x-1oo对照组的平均吸光值。.....
....(2)
需要计算每个阳性对照，阴性对照和试验样品吸光值的平均值，标准差（SD）和变异系数（CV）。8.3结果分析
8.3.1试验样品为纳米材料原材料时，由MTT试验数据和LDH试验数据绘制得到浓度-反应曲线对于所得到的浓度-反应曲线，需要对其反应曲线方程进行非线性拟合，从获得的方程式中计算IC50。注：本标准中ICso是指MTT试验结果中相对细胞活性（相对增殖率）的抑制率达到50%时的试验样品浓度和LDH试验结果中细胞LDH相对释放率为50%时的试验样品浓度。8.3.2试验样品为含纳米材料医疗器械的浸提液时，直接报告8.2.1，8.2.2的计算结果（包括平行样或重复孔的平均值主标准偏差）。9接受准则
9.1试验质量控制：
a）每次试验中应设阳性对照和阴性对照；b）
溶剂对照组（未做任何处理）的0D570应大于或等于0.2，以证实接种的1×10+细胞/每孔是否在2d的试验过程中处在正常的倍增生长期9.2对于乙酰氨基酚（APAP）阳性对照组.其24h的细胞增殖率不超过50%，且LDH总释放率应大于10%。
9.3如果该浓度试验组的细胞相对活性（增殖率）与溶剂对照组相比<70%，则判断该浓度有细胞毒性：试验组50%浸提液的细胞相对活性（增殖率）应至少等于或高于100%试验组浸提液的细胞相对活性（增殖率），否则，试验需要重做。9.4若满足9.2、9.3，则试验可接受，否则应重复试验。注：任何被排除的数值(异常值除外)也应在报告中说明。结果评定
总的试验结果应结合其试验样品的其他生物相容性试验结果和预期的临床使用用途进行评定细胞毒性试验结果的解释宜根据医疗器械的风险管理级别（GB/T16886.1)，结合纳米材料的物理化学表征（如粒径大小、表面电荷，聚散状态等)充分讨论所可能引起的潜在风险。如果试验结果提示有细胞毒性，必要时可进行进一步的评价，如：a）增加试验（有血清和无血清、或改变血清的浓度）；b）浸提液分析（如灭菌或加工过程的残留物分析）。6
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许多纳米材料被证实具有一定的细胞毒性，而有些纳米材料，如纳米银本身具有抗菌杀菌作用，具有较强的细胞毒性。至于试验样品的细胞毒性是否能被预期的临床使用所接受则需要综合分析，或者进一步进行动物试验来综合判断其人体使用时可能的风险YY/T0993—2015
附录A
（资料性附录）
试剂、耗材及设备
3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基-2氢-四氮唑溴盐（MTT）。对乙酰氨基酚（APAP）。
二甲基亚砜（DMSO）。
甘氨酸（Glycine）。
氯化钠（NaCI)。
三硝基甲苯X-100（Triton-X-100）。细胞培养液（MEM）。
胎牛血清（FBS)。
LDH-细胞毒性检测试剂盒。
磷酸盐缓冲液（PBS）。
双抗(PS)。
96孔平底细胞培养板
细胞冻存管。
培养瓶。
微孔板分光光度计（酶标仪）。A.3.2
可放置96孔板的离心机。
CO细胞培养箱。
4恒温水浴槽。
倒置显微镜。
5可放置96孔板的震摇器。
加样器。
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