【YY医药标准】 组织工程医疗产品 第7部分:壳聚糖

ICS_11.040.40
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0606.7--2008
组织工程医疗产品
第7部分：壳聚糖
Tissue engineered medical products-Part 7:Chitosan2008-04-25发布
国家食品药品监督管理局
2009-06-01实施
YY/T0606.7-2008
规范性引用文件
术语和定义
原材料和工艺要求
试验方法
检验规则
10包装、运输和贮存
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
附录D（规范性附录）
参考文献
重金属含量测定
蛋白质含量测定
乙醇残留量测定（气相色谱法）背景资料
YY/T0606《组织工程医疗产品》分为：前言
组织工程医疗产品
第1部分：通用要求；
第2部分：术语；
组织工程医疗产品
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第3部分：通用分类；
第4部分：皮肤替代品（物）的术语和分类；第5部分：基质及支架的性能和测试；第6部分：I型胶原蛋白；
第7部分：壳聚糖；
第8部分：海藻酸钠；
第9部分：透明质酸钠；
第10部分：修复或再生关节软骨的植人物的体内评价；第11部分：脱钙骨异位骨诱导性组织学评价指南；组织工程医疗产品
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第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南；第13部分：细胞自动计数法；
YY/T0606.7-—2008
第14部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：ELISA法：第15部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：淋巴细胞增殖反应试验；第16部分：保存指南；
第17部分：外源性因子评价指南；第18部分：海藻酸盐凝胶固定或微囊化指南；第19部分：修复和替代骨组织植入物骨形成活性的体内评价指南：第20部分：评价基质及支架免疫反应的试验方法：细胞迁移试验。组织工程医疗产品
本部分为YY/0606的第7部分。
本部分的附录A、附录B、附录C是规范性附录，附录D是资料性附录。本部分由国家食品药品监督管理局提出。本部分由中国药品生物制品检定所归口。本部分起草单位：上海其胜生物制剂有限公司、中国药品生物制品检定所。本部分主要起草人：顾其胜、蒋丽霞、奚廷斐、冯晓明、陈亮、章娜。I
1范围
组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖YY/T0606.7—2008
YY/T0606的本部分规定了用于制备组织工程医疗产品的壳聚糖原料的要求，试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存等要求。本部分适用于壳聚糖及其盐类，可用于制备组织工程医疗产品。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过YY/T0606的本部分引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可试用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T191包装储运图示标志
GB9969.1工业产品使用说明书
GB/T14233.2
GB/T16886.1
GB/T16886.3
GB/T16886.5
GB/T16886.6
医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验医疗器械生物学评价第3部分：遗传毒性，致癌性和生殖毒性试验医疗器械生物学评价
第5部分：体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第6部分：植人后局部反应试验GB/T16886.10E
医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验GB/T16886.11
医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验GB/T16886.12
医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品YY0466.1
医疗器械用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号第1部分：通用要求医用高分子制品包装、标志、运输和贮存YY/T0313
YY/T0771.1
动物源医疗器械第1部分：风险管理应用动物源医疗器械第2部分：来源、收集与处置的控制YY/T0771.2
YY/T0771.3
3动物源医疗器械第3部分：病毒和传播性海绵状脑病（TSE）因子去除与灭活的确认
中华人民共和国药典（2005年版）二部3术语和定义
下列术语和定义适用于YY/T0606的本部分。3.1
壳聚糖chitosan
由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡哺葡萄糖(GlcNAc）和2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖（GlcN）通过β(1-→4连接而成的线性多糖。壳聚糖是由甲壳素通过脱N-脱乙酰基作用生成的多糖。1
YY/T0606.72008
脱乙酰度degreeof deacetylation个壳聚糖分子中葡萄糖胺单元（脱乙酰基的单元）的摩尔分数。4分类
4.1壳聚糖按照溶解性质不同可分为酸溶性壳聚糖和水溶性壳聚糖。4.2壳聚糖盐类可分为壳聚糖盐酸盐、壳聚糖醋酸盐和壳聚糖谷氨酸盐。5原材料和工艺要求
动物源性的壳聚糖和壳聚糖盐，应按照YY/T0771.1、YY/T0771.2、YY/T0771.3的要求进行管理和控制。
稳定性：结合高分子材料的功能来描述壳聚糖的稳定性，应考虑黏度（表观黏度和特性黏度）和分子量在规定储存条件下的变化。
灭菌方法对分子量的影响：无论选择丫射线灭菌、过滤灭菌或湿热灭菌，应该考虑灭菌方法对分子量的影响，分子量变化会导致黏度变化。选择这些灭菌方法需要考虑产品的最终用途，确保黏度或者分子量在规定的范围内。
注：这里的原材料是指制备壳聚糖原料所用的蟹壳、虾壳等动物源性材料。6要求
6.1性状
白色或淡黄色粉末状，丝状或片状的固体。6.2
傅里叶变换红外光谱（FT-IR）
壳聚糖或壳聚糖盐典型的FT-IR频率（cm-1)如表1所示：表1红外光谱
注：s表示强峰；b表示宽峰。
壳聚糖醋酸盐
壳聚糖盐酸盐
宽峰（b)数值偏差不大于100cm-1，其他峰数值偏差不大于20cm-16.3脱乙酰度
标示值的90%~110%。
壳聚糖谷氨酸盐
2.5mg/mL浓度溶液的pH为4.0～6.0（仅对壳聚糖盐进行规定）。5动力黏度
标示值的80%～120%。
重金属含量
≤10μg/g（质量分数）。
蛋白质含量
<0.2%（质量分数）。
乙醇有机溶剂）残余量
<0.5%（质量分数）。
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注：如在加工过程中使用了除乙醇之外的其他有机溶剂，应建立相应的检验指标和检验方法。6.9
干燥失重
≤10%（质量分数）。
<0.5%（质量分数）。
6.11不溶物
≤0.5%（质量分数）。
细菌内毒素含量
<0.5EU/mg.
注：如果以非无菌的方式提供，则最终用户需进行去除细菌内毒素的处理以达到细菌内毒素限量要求。6.13无菌试验
应无菌。
注1：如果壳聚糖以非无菌的方式提供，则最终用户需进行灭菌处理以达到无菌要求。注2：如果采用环氧乙烷灭菌，应对其残留量进行控制和检测。6.14
生物学性能
壳聚糖应按照GB/T16886.1的要求进行生物学评价，应不释放出对人体有不良作用的物质。6.14.2
细胞毒性试验
细胞毒性反应不大于1级。
致敏试验
应无致敏反应。
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6.14.4皮内反应试验
平均记分之差不大于1。
6.14.5急性全身毒性
无急性全身毒性。
6.14.6遗传毒性试验
无遗传毒性。
6.14.7皮下植入试验
皮下植人12周后，组织反应与对照无显著差异。6.14.8溶血试验
溶血率应不大于5%。
7试验方法
7.1性状
使用肉眼直接观测，应符合6.1规定。7.2傅里叶变换红外光谱（FT-IR）按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录IVC规定的方法测定，应符合6.2规定。注：用漠化钾压片作为仲裁方法。7.3脱乙酰度
脱乙酰度可采用以下方法测定，但不限于以下方法，结果应符合6.3规定。7.3.1酸碱滴定法
准确称取在105℃下干燥至恒重的样品0.2g～0.5g，置于250mL锥形瓶中，加人标准0.1mol/L的盐酸溶液30mL，在20℃～25℃下搅拌至完全溶解（可加人适量蒸馏水稀释）。加人5～6滴甲基橙-苯胺蓝（将0.1%的甲基橙水溶液和0.1%苯胺蓝水溶液以1：2体积比混合）为指示剂，用标准氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴至变成浅蓝色。按式(1)和式(2)计算：(c,V,-c,V,)×0.016
203×p
16+42×pwwW.bzxz.Net
式中：
样品中氨基含量，%；
盐酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L)；盐酸标准溶液的体积，单位为升（L）；氢氧化钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）：氢氧化钠标准溶液的体积，单位为升（L)（1）
（2）
0.016与1mL1mol/L盐酸溶液相当的氨基量；m
-样品质量，单位为克（g）：
D样品的脱乙酰度，%。
7.3.2双突跃电位滴定法
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准确称取在105℃下干燥至恒重的样品0.2g～0.5g，加入过量的0.1mol/L盐酸（HCl)，搅拌至完全溶解。然后在电位滴定装置上用氢氧化钠（NaOH)标准溶液滴定，氢氧化钠（NaOH)溶液首先中和过量的盐酸（HCI)，pH出现急剧上升，即第一个突变，然后氢氧化钠（NaOH)标准溶液再中和与壳聚糖一NH，结合的盐酸（HCI)，达到滴定等当点时，pH出现第2个突变，两个突跃点消耗的氢氧化钠(NaOH)摩尔数相当于样品中的一NH2摩尔数。按式(3)计算：AVXCNaOHX10-X16
式中：
样品的脱乙酰度，%；
一两突跃点之间消耗的氢氧化钠（NaOH)标准溶液体积之差，单位为毫升（mL）：-NaOH标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L)；样品质量（去除水分），单位为克（g）；氨基的相对分子质量：
0.0994——理论氨基含量。
注：以方法7.3.2为仲裁方法。
7.4pH测定
（3）
用蒸馏水配制成浓度为2.5mg/mL壳聚糖盐溶液，完全溶解后，按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录VH测定，应符合6.4规定。5动力黏度测定
壳聚糖/壳聚糖盐用1%醋酸溶液/蒸馏水溶解至浓度为10mg/mL的溶液，采用旋转式黏度计，在剪切速率≥0.25Hz，25℃土2℃条件下，按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录VIG第二法测定，应符合6.5规定。
7.6重金属含量测定
按照附录A规定的方法测定，应符合6.6规定。7.7
蛋白质含量测定
按照附录B规定的方法测定，应符合6.7规定。7.8乙醇（有机溶剂）残余量测定乙醇残余量按照附录C规定的方法测定，应符合6.8规定。7.9
干燥失重
按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录ⅢL规定的方法测定，在105℃土2℃下干燥至恒重，按照干燥后重量与取样量进行计算，应符合6.9规定。5
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7.10灰分测定
精密称取壳聚糖壳聚糖盐1.0g，按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录MlN规定的方法测定，800℃灼烧6h，应符合6.10规定。7.11不溶物测定
将2.00g壳聚糖/壳聚糖盐溶解在400mL1%醋酸溶液/蒸馏水中，搅拌至完全溶解。将溶液转移至2L容器中，加人200mL蒸馏水。加热至沸腾文火保持2h，加热过程中盖住烧杯口。用砂芯漏斗（3）过滤，用水洗涤残留物，并在100℃～105℃烤箱中干燥至恒重。残留物的含量应符合6.11规定。7.12内毒素含量
壳聚糖用1%（体积分数）醋酸溶液（细菌内毒素检查用水配制）或壳聚糖盐用细菌内毒素检查用水溶解，按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录IVA规定的方法测定，应符合6.12规定。7.13无菌试验
在无菌操作条件下按照《中华人民共和国药典》（2005年版）二部附录XJ规定的方法测定，应符合6.13规定。
7.14生物学性能
样品制备方法
按照GB/T16886.12规定的方法制备实验样品，除另有规定外，壳聚糖采用浸提液，壳聚糖盐配制成1%的溶液，溶液混合均勾后作为试验液供下述实验使用。7.14.2细胞毒性试验
按照GB/T16886.5规定的方法测定，应符合6.14.2规定。7.14.3致敏试验
按照GB/T16886.10规定的最大剂量方法测定，应符合6.14.3规定。7.14.4皮内反应试验
按照GB/T16886.10规定的方法测定，应符合6.14.4规定。7.14.5急性全身毒性
按照GB/T16886.11规定的腹腔注射方法测定，应符合6.14.5规定。7.14.6遗传毒性试验
按照GB/T16886.3规定的方法进行测定，应符合6.14.6规定。7.14.7皮下植入试验
按照GB/T16886.6规定的方法测定，应符合6.14.7规定。7.14.8溶血试验
按照GB/T14233.2规定的溶血试验方法测定，应符合6.14.8规定。6
检验规则
壳聚糖以同批投料，同一生产过程生产的产品为同一批号。出厂检验
出厂检验项目为7.1，7.3～7.12出厂检验时，若所有检验项目全部合格，则判定为合格，否则判定为不合格。型式检验
型式检验为全性能检验。
型式检验时，若所有检验项目全部合格，则判定为合格，否则判定为不合格。标志
大包装应有下列标志：
生产厂名和地址；
产品名称：
执行标准编号；
分类和规格；
生产批号或日期；
失效日期；
贮存条件。
小包装应有下列标志：
产品名称；
生产厂名和地址；
分类和规格；
生产批号或日期；
原料来源；
失效日期；
贮存条件；
灭菌方法。
储运标志：应符合GB/T191中的规定。包装、运输和贮存
应采用适宜的包装，确保壳聚糖产品的安全性和有效性。2产品的包装、贮存、运输应符合YY/T0313的规定，10.2
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A.1原理
附录A
（规范性附录）
重金属含量测定
壳聚糖或壳聚糖盐经强酸消化后，铅离子与硫代乙酰胺作用显色。A.2溶液制备
A.2.1醋酸盐缓冲液（pH3.5）：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH至3.5（电位法指示），用水稀释至100mL，即得，A.2.2硫代乙酰胺试液：取硫代乙酰胺4g，加水使溶解成100mL，置冰箱中保存。临用前取混合液（由1mol/L氢氧化钠溶液15mL、水5.0mL及甘油20mL组成）5.0mL，加上述硫代乙酰胺溶液1.0mL，置水浴上加热20s，冷却，立即使用。A.2.3硫酸和硝酸的混合液：准确量取硫酸8mL和硝酸10mL，混匀。A.2.4标准铅（Pb)溶液：称取硝酸铅0.160g，置1000mL容量瓶中，加硝酸5mL与水50mL溶解后，用水稀释至刻度，摇勾，作为贮备液。临用前，精密量取贮备液10mL，置100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（1mL相当于10μg的Pb)。
注：配制与贮存用的玻璃容器均不得含铅。A3
测定步骤
精密称取壳聚糖或壳聚糖盐约1.0g于一干燥，清洁的100mL定氮瓶中，加人硫酸和硝酸混合A.3.1
液至完全浸湿样品。
缓慢加热上述溶液使其反应，待反应变缓时将定氮瓶移离火源加人一定量的硫酸和硝酸混合A.3.2
液，继续加热，重复上述操作几次，直至18mL硫酸和硝酸混合液全部加完。A.3.3提高加热温度，煮沸至溶液变黑，冷却，加人2mL硝酸再加热至溶液变黑。重复上述过程至溶液不再变黑为止。
A.3.4提高加热温度至产生白烟。冷却，加人5mL蒸馏水，缓慢加热煮沸至溶液减少到2mL~3mL。冷却，再加入5mL蒸馏水并观察溶液颜色。如果呈黄色，则缓慢加人1mL浓过氧化氢溶液，加热至体积减少至2mL～3mL。如果溶液仍呈黄色，重复上述操作过程至溶液呈无色。A.3.5冷却，用蒸馏水稀释，将溶液转移至50mL比色管中，溶液体积不能超过25mL。A.3.6加人浓氨水，用精密pH试纸调节溶液pH至3.0～4.0可以使用稀氨水调节pH)，用蒸馏水将溶液稀释至40mL并混匀。
A.3.7加人pH3.5的醋酸盐缓冲液2mL和1.2mL硫代乙酰胺试液，迅速混勾。用蒸馏水稀释至50mL，混勾。
取1mL标准铅溶液（10pg/mL)同样处理。A.4结果判定
将比色管置于白色背景中，2min后观察，待测样品溶液颜色不应比对照溶液更深。8
B.1原理
附录B
（规范性附录）
蛋白质含量测定
YY/T0606.7—2008
库马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue)G-250具有两种色调，在游离状态下呈红色，与蛋白质结合后转为青色，且其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比。且其颜色在595nm处有最大光吸收，可用分光光度计进行测定。
B.2设备
分析天平。
紫外分光光度计。
旋涡式混合器。
B.3溶液制备
B.3.1库马斯亮蓝G-250试液：称取库马斯亮蓝G-250100mg溶解于50mL的95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，并用蒸馏水稀释至1000mL，置于棕色瓶内，室温贮存。B.3.2蛋白质标准液（30μg/mL）：精确吸取5%牛血清白蛋白标准液0.6mL于1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，4℃下贮存。注：实验所用试剂均为分析纯。B.4样品准备
精确称取105℃士2℃于燥至恒重的壳聚糖/壳聚糖盐约0.005g，置于样品管中，加1mL1%醋酸溶液/蒸馏水后，充分振荡混勾，使其完全溶解。B.5
测定步骤
按表B.1制备蛋白质标准液系列。B.5.1
蛋白质标准溶液系列浓度
试管号
蛋白质标准溶液/mL
1%醋酸溶液-蒸馏水/mL
蛋白质浓度/(μg/mL）
B.5.2在标准液系列的各试管及样品试管中分别加人5mL的库马斯亮蓝G-250溶液。用旋涡式混合9
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